一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?nbsp;
學(xué)習(xí)和掌握DNA的微量提取法。

二、實(shí)驗(yàn)原理 
小麥黃化苗經(jīng)液氮研磨，可使細(xì)胞壁破裂，加入去污劑（如SDS），可使核蛋白體解析，然后使蛋白和多糖雜質(zhì)沉淀，DNA進(jìn)入水相，再用酚、氯仿抽提純化。本實(shí)驗(yàn)采用SDS法，其主要作用是破膜。SDS屬陰離子去污劑，要溶解膜蛋白與脂肪，也可解聚核蛋白。SDS在溶液中帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的蛋白質(zhì)側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合物，當(dāng)加入鉀鹽時(shí)，能與SDS－蛋白質(zhì)生成溶解度很小的沉淀一同去除。酚/氯仿/異戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白質(zhì)，并有利于水相與有機(jī)相的分開，而且可以消除泡沫。異丙醇或乙醇的作用是沉淀DNA。 
處理DNA樣品時(shí)，可在65℃保溫30min，較之37℃處理有以下優(yōu)點(diǎn)：①rna酶的zui適作用溫度為65℃；②DNA酶zui適作用溫度為37℃，當(dāng)用65℃處理時(shí)，這些酶往往處于活性極低的狀態(tài)而不會(huì)降解DNA；③RNA中的某些總分會(huì)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，65℃處理更有利于這些結(jié)構(gòu)的松散，使RNA酶的作用更*。

三、藥品 
1．提取緩沖液 
100mmo/L NaCl 
100mmol/L Tris-Cl（pH8.0） 
50mmol/L EDTA 
1%疏基乙醇 
2．20％SDS 
3．5mol/L 
取29.5ml冰醋酸，用KOH顆粒調(diào)校至PH4.8，加水至100ml，室溫保存，不可滅菌。 
4．酚/氯仿/異戊醇（25：24：1） 
5．異丙醇 
6．70％乙醇

四、實(shí)驗(yàn)流程 
1.稱取0.1g小麥黃化苗葉片于預(yù)冷的研缽中，加入3倍體積(W/V，約300μl)提取緩沖液，在冰盤上研磨。 
2.研碎后轉(zhuǎn)入一EP管中，再加約300μl提取緩沖液。 
3.加入20％SDS至終濃度為2％，約66μl。 
4.輕輕混勻后于65℃水浴，10min。 
5.加入1/10體積的5mol/L(約66μl)，于水浴中反應(yīng)30min。 
6.離心（15krpm,10min,4℃）。 
7.取上相轉(zhuǎn)入一新的EP管中，用等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）抽提一次（上下晃動(dòng)幾次即可）。 
8.離心（12krpm,10min,20℃）。 
9.取上相轉(zhuǎn)入一新的EP管中，加入等體積的異丙醇，于室溫下反應(yīng)5~10min，其間將管至少顛倒5次。 
10．離心（15krpm,10min,4℃）。 
11．棄上清液，用70％乙醇沖洗沉淀物，真空抽干或吹干，zui后溶于1×TE中（約50μl）。

五、注意事項(xiàng) 
1.研磨后應(yīng)迅速加入提取液，因?yàn)樘崛∫褐泻珽DTA，能夠螯合Mg2+等二價(jià)陽(yáng)離子，防止破碎細(xì)胞中的dna酶降解DNA。 
2.提取過程中，轉(zhuǎn)移上清液時(shí)所用的槍頭用剪刀將尖頭剪去，以避免對(duì)DNA造成的不必要的機(jī)械損傷。 
3.干燥DNA時(shí)，要注意，過干或過濕都不利于DNA的溶解。

所需器材及用具 
冰盤（4個(gè)）、研缽（8套）、塑料燒杯（8個(gè)）、200μl微量加樣器（2把）、離心機(jī)（1臺(tái)）、水浴鍋（65℃）、槍頭及EP管