目的 利用競爭PCR法建立分級(jí)測(cè)定HBV DNA含量的定量方法.
方法 設(shè)立3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)競爭模板(102cop, 104 cop, 106cop)，分別和恒量的待測(cè)模板混合，分別進(jìn)行40，30，20次循環(huán)的pcr擴(kuò)增，zui后凝膠電泳分離待測(cè)模板和競爭模板的PCR產(chǎn)物，測(cè)定兩者的熒光強(qiáng)度的比值，計(jì)算待測(cè)模板的初始量.
結(jié)果 對(duì)乙型肝炎血清HBV DNA定量表明，12份HBeAg陽性血清，HBV DNA的血清濃度在6×107～1×1011cop/L，而12份HBeAb陽性血清只有7份可檢出HBV DNA，它們的血清濃度均在3×108cop/L以下，其余5份用該P(yáng)CR方法，檢測(cè)不到.
結(jié)論 該方法可用于HBV DNA以及其他病原體DNA的定量.
Grading quantitative PCR to measure serum HBV DNA levels
GUO Yan-Hai1, REN Feng-Ling2, YAN Xiao-Jun1 and SU Cheng Zhi1
1Chinese PLA Institute of GENE Diagnosis, Xi"an 710033, Shaanxi Province, China
2Environmental Health Department of Xi"an Medical University, Xi"an 710061, Shaanxi Province, China
Subject headings hepatitis B virus; DNA, viral/analysis; polymerase chain reaction
Abstract
AIM To set up a new method of measuring serum HBV DNA levels with grading quantitative PCR.
METHODS Three standard competition DNA templates (102 cop, 104 cop, 106 cop) were mixed separay with stable sample DNA templates, and then PCR with 40, 30 and 20 cycles was carried out. Then the PCR products of the sample DNA templates were separated from that of the competition DNA complates, and the fluorescence intensity ratio of them were measured. The initial contents of the sample DNA templates were calculated.
RESULTS The serum HBV DNA contents of the 12 samples of HBeAg positive serum ranged from 6×107 to 1×1011cop/L. Only 7 of the 12 HBeAb positive serum could be detected and their HBV DNA were all below 3×108cop/L and the other 5 samples HBV DNA could not be detected with PCR.
CONCLUSION This method can be used to measure the HBV DNA and other pathogenic DNA.
0引言
PCR技術(shù)對(duì)基因從定性到定量的測(cè)定是分子生物學(xué)方法研究一大飛躍，定量PCR已成為目前分子生物學(xué)技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一. 迄今研究和應(yīng)用的定量PCR方法有4種，即PCR產(chǎn)物的直接定量；極限稀釋法；靶基因與參照基因的同步擴(kuò)增；競爭性PCR法. 以上方法各有利弊，選擇某一方法取決于靶基因的特性，對(duì)準(zhǔn)確度的要求，需要相對(duì)還是的定量. 其中競爭性PCR方法的定量比較準(zhǔn)確，被較多地采用［1］. 但該方法在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，需將恒量的樣品DNA與一系列稀釋的各種濃度的競爭性模板混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，zui后進(jìn)行電泳，找出待測(cè)模板與競爭性模板終產(chǎn)物有相等摩爾數(shù)的一個(gè)反應(yīng)，從而確定待測(cè)模板的初始量. 因此，對(duì)一個(gè)樣品定量時(shí)需要進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)，不適應(yīng)多樣品的同時(shí)定量測(cè)定. 我們建立了分級(jí)定量方法，只用3種濃度的競爭模板與恒定量樣品DNA進(jìn)行3個(gè)PCR反應(yīng)，通過測(cè)定待測(cè)模板與競爭模板的終產(chǎn)物熒光強(qiáng)度比值，來確定待測(cè)樣品DNA的初始模板量. 該方法適合多樣品同時(shí)測(cè)定.

1 材料和方法

1.1 材料 GQS-960凝膠成像分析系統(tǒng)(第四軍醫(yī)大學(xué)基因診斷技術(shù)應(yīng)用研究所)，Thermolyne PCR擴(kuò)增儀(美國),Taq DNA聚合酶，dNTP (Promega公司). 引物出自HBV DNA的X區(qū)，經(jīng)oligo軟件設(shè)計(jì). 引物位置和序列為：B1(1402-1421)，5,-ATC CTGCGCGGGACGTCCTT3；B2(1626-1607)5,-CGTTCACGGTGGTCTCCATG3擴(kuò)增比較為225bp，