*節(jié) 概 述 從真核生物的組織或細(xì)胞中提取mRNA,通過酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的*鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉(zhuǎn)化擴(kuò)增, 即可獲得cDNA文庫,構(gòu)建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控的分析;比較cDNA和相應(yīng)基因組DNA序列差異可確定內(nèi)含子存在和了解轉(zhuǎn)錄后加工等一系列問題?？傊甤DNA的合成和克隆已成為當(dāng)今真核分子生物學(xué)的基本手段。自70年代中葉*cDNA克隆問世以來,已發(fā)展了許多種提高cDNA合成效率的方法,并大大改進(jìn)了載體系統(tǒng)，目前cDNA合成試劑已商品化。cDNA合成及克隆的基本步驟包括用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA*鏈,聚合酶合成cDNA第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到于適當(dāng)載體(噬菌體或質(zhì)粒)。
一、RNA制備
模板mRNA的質(zhì)量直接影響到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解,加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染,并設(shè)法抑制其活性,這是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。所有的組織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實(shí)驗(yàn)過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈。DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物,因而使用時需小心。試驗(yàn)所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復(fù)合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理。
細(xì)胞內(nèi)總RNA制備方法很多,如異硫氰酸胍熱法等。許多公司有現(xiàn)成的總rna提取試劑盒,可快速有效地提取到高質(zhì)量的總RNA。分離的總RNA可利用mRNA 3"末端含有多聚(A)+ 的特點(diǎn),當(dāng)RNA流經(jīng)oligo (dT)纖維素柱時,在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然后逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA被洗下。經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 
二、cDNA*鏈的合成
所有合成cDNA*鏈的方法都要用依賴于RNA的dna聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)來催化反應(yīng)。目前商品化反轉(zhuǎn)錄酶有從禽類成髓細(xì)胞瘤病毒純化到的禽類成髓細(xì)胞病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和從表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶。AMV反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴于RNA的DNA合成,依賴于DNA的 DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉(zhuǎn)錄酶只有單個多肽亞基,兼?zhèn)湟蕾囉赗NA和依賴于DNA的DNA合成活性,但降解RNA:DNA雜交體中的RNA的能力較弱,且對熱的穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差。MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶利用RNA模板合成cDNA時的zui適pH值,zui適鹽濃度和zui適溫室各不相同,所以合成*鏈時相應(yīng)調(diào)整條件是非常重要。 
AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MLV反轉(zhuǎn)錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成zui常用的引物是與真核細(xì)胞mRNA分子3"端poly(A)結(jié)合的12-18核苷酸長的oligo(dT)。
三、cDNA第二鏈的合成
cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種: 
(1) 自身引導(dǎo)法 合成的單鏈cDNA 3"端能夠形成一短的發(fā)夾結(jié)構(gòu),這就為第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物,當(dāng)*鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第二鏈,zui后用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環(huán),即可進(jìn)一步克隆。但自身引導(dǎo)合成法較難控制反應(yīng)，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時無一例外地將導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA 5"端序列出現(xiàn)缺失和重排,因而該方法目前很少使用。 
(2) 置換合成法 該方法利用*鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列RNA引物,使之成為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應(yīng)有3個主要優(yōu)點(diǎn): (1) 非常有效; (2) 直接利用*鏈反應(yīng)產(chǎn)物,無須進(jìn)一步處理和純化; (3) 不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。目前合成cDNA常采用該方法。
四、cDNA的分子克隆 
已經(jīng)制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣,可以插入到質(zhì)?；蚴删w中,為此,首先必需連接上接頭(Linker),接頭可以是限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)片段,也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進(jìn)行擴(kuò)增。合成的cDNA也可以經(jīng)PCR擴(kuò)增后再克隆入適當(dāng)載體。 第二節(jié) 動植物組織mRNA提取
第三節(jié) 植物病毒RNA提取 第四節(jié) cDNA合成技術(shù)