平端連接

通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效 率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能 在兩6條DNA鏈的3"末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為 3"突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR 產(chǎn)物的效率通過較高，。在采用大量T4dna連接酶并配以5—10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19 的HincⅡ位點進行克隆，以X－gal和IPTG篩選，?？傻玫阶懔恐亟M 子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3"末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法 克隆PCR產(chǎn)物。

粘端連接

引物中設計入限制酶位點：由于PCR引物的5"末端可以增加一些非 互補堿基，因此可以在兩引物的5"末端設計單限制酶或雙限制酶切 位點。這樣得到的PCR產(chǎn)物用限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與有互 補粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當兩引物中設計 不同酶切位點時，可有效地定向克隆PCR產(chǎn)物。其缺點是需要加長 PCR引物，除限制酶識別序列外，還需要在其5"端多合成3—4個堿基 以利于限制性內切酶與PCR產(chǎn)物末端的穩(wěn)定結合。即使如此，其酶切 效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變 PCR方法可克服上述缺點。該方法是通過在兩PCR引物序列中改變1至 數(shù)個核苷酸創(chuàng)造出一個限制性內切酶位點。鑒于PCR引物的3"末端序 列的互補性是PCR成功的關鍵，在PCR引物的中部或近5"端改變1個或 幾個堿基對PCR擴增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的 長度，而且酶切效果優(yōu)于5"加端法。對于特定DNA片段的克隆，此方 法較為經(jīng)濟、實用。但對于基因診斷PCR產(chǎn)物的克隆，似乎5"加端法 更為適宜。

T4DNA聚合回切產(chǎn)生粘端

如PCR兩引物的5"末端是A或T，則可在 其5"端分別加上CG和CCGG。用此二引物擴增的PCR產(chǎn)物在dATP和dTTP 存在的情況下，用T4dna聚合酶進行處理，則T4DNA聚合酶因具有3"→ 5"外切酶活性而消去3"末端的G和C，產(chǎn)生AccI和XmaI粘性末端（圖1）。 此DNA片段直接與用AccI和XmaI切開的載體進行連接。這種方法只需 在PCR引物的5"端加2—4個堿基，但其可選擇的限制酶類有限。

T－vector法

TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3"末端加一個堿 基，所加堿基幾乎全是腺苷。據(jù)此，Marchuk等人采用3"端突出一個 胸苷的質粒dna來克隆PCR產(chǎn)物，其克隆效率比平端的連接至少高出 100倍。他們用EcoRV將pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP 存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的兩個3"末端各加一處胸 苷。因為在4種dNTP都存在時，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當僅 一種dNTP存在時，它只能參入該種堿基。因此，在只加入ddTTP時， 用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉變成3"末端突出一個胸苷的T尾 載體，稱為T－vector。用這種T－vectorsk可以較有效地直接克隆 PCR產(chǎn)物。Hotton等人也報道了另一種制備T－vector的方法。他們 使用脫氧核苷酸末端轉移酶在切成平端的載體DNA的3"末端加上一個 胸苷。由于末端轉移酶可以催化多個堿基（ddTTP）作為底物，使平 端載體DNA分子的兩個3"末端各加上一個T。用這種方法制備的T－vector 的不同之處在于前者3"末端不能與待克隆PCR產(chǎn)物的5"末端連接，僅 5"末端可與PCR產(chǎn)物的3"末端形成磷酸二脂鍵。

共環(huán)消解法：zui近，Jung等人報道了一種有效的PCR產(chǎn)物克隆方 法。用磷酸化的PCR引物擴增得到的PCR產(chǎn)物，先用T4DNA連接酶催化 連接反應，使5"端帶有限制酶切位點的擴增DNA片段連接成共環(huán)結 構。然后再用相應的限制酶進行消化，產(chǎn)生粘端DNA片段。對于對稱 性限制酶位點，只需在引蛾的5"末端加上一關識別序列，因為在串 接成共環(huán)后能恢復限制酶切位點難于切開的缺點，且可用于雙限制 酶切位點的設計，只不過有PCR產(chǎn)物共環(huán)化后，僅約1/4的限制酶切 點得以恢復。故此法較適用于單限制酶位點的克隆。