蛋白測定是在生命科學(xué)研究中zui廣泛應(yīng)用的方法之一。在蛋白提純，電泳，免疫分析，細(xì)胞生物，分子生物和其他研究應(yīng)用時(shí)評估蛋白濃度是必需的。雖然目前有各種不同的蛋白測定方法，但仍然還沒有一種測定方法被認(rèn)為是廣泛適合于所有的應(yīng)用要求。每種方法都有它的優(yōu)點(diǎn)和限制。一般來說，研究中經(jīng)常需要用到一種以上的蛋白測定方法以排除一些未知的物質(zhì)的干擾。
大多數(shù)蛋白樣品可通過比色測定法定量。在典型的蛋白測定中，化學(xué)試劑加入到蛋白樣品溶液里產(chǎn)生顏色變化，這一變化可由分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測，并與已知濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。博士德為大家提供兩種蛋白測定手段，每種都有其*的優(yōu)點(diǎn)。如果樣品數(shù)量較多，可以同時(shí)使用兩種測定用酶標(biāo)儀自動檢測。當(dāng)你選擇一種蛋白測定方法時(shí)需要考慮兩個(gè)因素：緩沖液的化學(xué)組成和檢測的蛋白量。
Commassie法（Bradford法）：
原理：在酸性條件，蛋白質(zhì)與考馬斯染料G-250結(jié)合，顏色從棕色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm處檢測吸光值然后與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計(jì)算出待測蛋白的濃度。
BCA法：
原理：在堿性條件下，蛋白將Cu++還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計(jì)算待測蛋白的濃度。
現(xiàn)對這兩種方法進(jìn)行比較：
一、實(shí)驗(yàn)材料：
細(xì)胞總蛋白提取試劑盒（AR0103）
M231
BCA蛋白定量試劑盒（AR0146）
Commassie改良增強(qiáng)型蛋白質(zhì)定量試劑盒（AR0145）
二、操作步驟：
Commassie法：
1.將BSA凍干標(biāo)準(zhǔn)品（10mg/支）用生理鹽水或PBS稀釋成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八個(gè)濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2.M231用細(xì)胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。
3.各取20ul蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測M231樣品至相應(yīng)標(biāo)記的微孔板中。
4.滴加200ul考馬斯增強(qiáng)型試劑（溶液A）至每孔混勻并充分震蕩30S
5.停止震蕩，在室溫孵育樣品10min
6.在酶標(biāo)儀中測量595nm時(shí)的吸光值。
7.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷出樣品的蛋白濃度。
BCA法：
1.按50體積BCA試劑A加入1倍體積BCA試劑B配置適量BCA工作液，充分混勻。
2.將BSA凍干標(biāo)準(zhǔn)品（10mg/支）用生理鹽水或PBS稀釋成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八個(gè)濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.M231用細(xì)胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。
4.各取20ul蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測M231樣品至相應(yīng)標(biāo)記的微孔板中。
5.滴加200ulBCA工作液至每孔混勻并充分震蕩30S
6.停止震蕩，在37度孵育樣品30min
7.在酶標(biāo)儀中測量562nm時(shí)的吸光值。
8.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷出樣品的蛋白濃度。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Commsie法吸光值 | 0.530 | 0.522 | 0.431
| 0.262 | 0.118 | 0.041
| 0.001
|
| BCA法吸光值 | 0.812 | 0.444 | 0.257
| 0.140
| 0.06 | 0.037
| 0.017
|
其中1到8為2000ug/ml，1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625的標(biāo)準(zhǔn)濃度的BSA蛋白，9為空白孔，樣品1為8倍稀釋M231總蛋白，樣品2為32倍稀釋M231總蛋白
Commassie法：
為了測試準(zhǔn)確，應(yīng)在試劑加入后的5～20min內(nèi)測定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是zui穩(wěn)定的。 由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以算出樣品原始濃度為14.4mg/ml
Commassie法優(yōu)點(diǎn)是：
1.靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其zui低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1ug。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。
2.測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性。
3.干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
此法的缺點(diǎn)是：
1.由于各種蛋白質(zhì)中的和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。
2. 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1M的NaOH。（如同0.1M的酸干擾Lowary法一樣）。
3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，在0-1000ug/ml濃度范圍內(nèi)有較好線性。因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。
BCA法：
由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以算出樣品原始濃度為14.28mg/ml
BCA法特點(diǎn)： 1. 靈敏度高，檢測濃度下限達(dá)到25μg/ml，zui小檢測蛋白量達(dá)到0.5μg，待測樣品體積為1-20μl 。 2. 測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達(dá)5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。 3. 在20-2000μg/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。 4. 檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。 5. 受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巰基乙醇低于1mM
BCA法和Commassie法各有優(yōu)勢，在不知道蛋白樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用，以消除定量的誤差。
