一、常規(guī)的試劑配制：

1、培養(yǎng)基：選用高糖型DMEM/F12 (1:1)培養(yǎng)基干粉（含15 mmol Hepes），每升培養(yǎng)液中加入1.8 g，調(diào)節(jié)pH值7.0，0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后，加入、無菌的和液，使其終濃度分別為0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分裝后置于4℃保存，臨用前加入2%的B27。神經(jīng)細胞代謝旺盛，選用高糖型培養(yǎng)基；可保持培養(yǎng)基還原狀態(tài)，營養(yǎng)成分穩(wěn)定；B27是*的刺激神經(jīng)元生長的營養(yǎng)因子，不過價格挺貴；PH值很關(guān)鍵，Hepes是的緩沖系統(tǒng)，pH值調(diào)好后能保持很長時間；

2、多聚賴氨酸溶液的配制： 稱取1.5 mg L-多聚賴氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，密封后置于4 ℃保存，可使用；

3、磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制： 稱取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4•12H2O和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，調(diào)節(jié)pH值為7.2，補dd H2O至1000 ml并分裝，高壓滅菌（121～126 ℃），4 ℃?zhèn)溆茫?/em>

4、D-Hanks液的配制：稱取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4•12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，調(diào)節(jié)PH值為7.2，定容至1000 ml，高壓蒸汽滅菌（121～126 ℃），4℃?zhèn)溆茫?/em>

5、0.25%的配制：稱取0.25 g粉末，少許D-Hanks溶液調(diào)成糊狀，用D-Hanks定容至100 ml，混勻，冰箱內(nèi)放置過夜，濾紙過濾后，0.22 ?m微孔濾膜過濾，分裝，-20 ℃保存。

二、試驗操作過程：

1、包被：培養(yǎng)前晚上將培養(yǎng)瓶（板）用多聚賴氨酸包被10 min，吸除，無菌操作臺上15min自然晾干，置于培養(yǎng)箱中備用；

2、取腦：選取新生24 h的SD大鼠數(shù)只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，斷頭處死，無菌條件下分層剪開頭皮、顱骨，用彎鑷拉開腦區(qū)視野，小心取出全腦，D-hanks液洗數(shù)次；（預(yù)先準(zhǔn)備至少4把眼科剪刀，分別用于斷頭、剪頭皮和剪顱骨及第3步的剪組織這4個操作）

3、分離：以腦中線為起點，小心撥開大腦顳葉皮層，暴露出新月狀海馬回，小心夾出海馬組織，置于冰浴的D-hanks液中，仔細剔除微血管，用充分剪碎組織；

4、消化：加入同體積0.125%的，瓶口用錫箔紙蓋上，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化20 min左右，期間輕搖數(shù)次；

過濾：加入數(shù)滴胎牛血清終止消化，用尖頭吸管輕輕吹打細胞數(shù)分鐘，至液體成米糊狀即停止吹打，動作要輕柔，用150目網(wǎng)篩過濾，收集細胞懸液；

5、接種：以1100 rpm離心5 min，傾去上清，用DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細胞，輕輕吹打，臺盼藍染色快速計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，調(diào)整細胞終濃度為1 00000個/ml，加入終濃度為10%胎牛血清后接種于培養(yǎng)瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12小時內(nèi)禁止晃動

6、換液：接種后24 h將培養(yǎng)液全量換成無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，第48 h時加入終濃度為10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細胞的過度生長，隨后每3 d半量換液。

此外，原代培養(yǎng)的海馬組織由多種細胞構(gòu)成，如成纖維細胞、膠質(zhì)細胞等，成分復(fù)雜，因此原代培養(yǎng)過程中細胞純化是關(guān)鍵的一步。本人主要采取以下措施來達到細胞純化：

（1）海馬組織取材時組織定位準(zhǔn)確，由于海馬游離于大腦皮層，這一點容易做到；

（2）消化前，細心剔除微血管；

（3）過濾時選擇150-200目篩網(wǎng)，盡量使培養(yǎng)的細胞呈單個或數(shù)個成團；

（4）接種24 h時需全量換培養(yǎng)基，除去未貼壁的死細胞；

（5）接種48 h時加一定濃度的阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細胞（膠質(zhì)細胞和少許成纖維細胞）的過度生長。

細胞生長7天的情況：