PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng))是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(DeNature):目的雙鏈DNA段在94℃下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的zui適溫度下,以目的DNA為模板進(jìn)行合成.由這三個基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍(圖4),這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106 倍。

一、 pcr反應(yīng)中的主要成份

1. 引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：(1) 引物長度約為16-30bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。(2) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm=4(G+C)+2(A+T).(3) 四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個G或C,因這樣易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。(4) 引物3'端與目的序列閱讀框架中密碼子*或第二位核苷酸對應(yīng), 以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。(5) 在引物內(nèi), 尤其在3'端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)。(6) 兩引物之間尤其在3'端不能互補, 以防出現(xiàn)引物二聚體, 減少產(chǎn)量。兩引物間不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。 (7) 引物5'端對擴(kuò)增特異性影響不大, 可在引物設(shè)計時加上限制酶位點、核糖 體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標(biāo)記、熒光素等. 通常應(yīng)在5'端限制酶位點外再加1-2個保護(hù)堿基。(8) 引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu), 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,影響產(chǎn)量。 (9) 簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3'端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。

一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體, 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計, 可計算引物濃度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計算：

X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)

X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T: 引物中4種不同堿基個數(shù)。

2. 4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP應(yīng)用NaOH 將pH調(diào)至7.0,并用分光光度計測定其準(zhǔn)確濃度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝,-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。理論上4 種 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反應(yīng)中合成2.6μg的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制Taq dna聚合酶的活性.4種dNTP的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。

3. Mg2+：Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實性,影響引物退火和解鏈溫度, 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2mmol/L.對于一種新的PCR反應(yīng),可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進(jìn)行預(yù)備實驗,選出zui適的Mg2+濃度。在PCR反應(yīng)混合物中, 應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán), 例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質(zhì),以保證zui適Mg2+ 濃度。

4. 模板：PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增, 模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好).就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102 -105 個拷貝,對于單拷貝基因,這需要0.1μg的人基因組DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大腸桿菌DNA.擴(kuò)增多拷貝序列時,用量更少.靈敏的PCR可從一個細(xì)胞,一根頭發(fā),一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列.模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物.DNA中的雜質(zhì)也會影響PCR的效率。

5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130min,95℃ 40min, 97℃ 5min.現(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶,這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間.Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,30min,摻入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量.Taq DNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率,一般PCR中出錯率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán),在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時尤應(yīng)注意.在100μl PCR反應(yīng)中,1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán).所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p.酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加,過少則使產(chǎn)量降低.反應(yīng)結(jié)束后,如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實驗,需要預(yù)先滅活Taq DNA聚合酶, 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR產(chǎn)物經(jīng)酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100℃加熱10min.目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。

6. 反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的Mg2+ . Tris·Cl在20℃時pH為8.3-8.8,但在實際PCR反應(yīng)中,pH為6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩(wěn)定酶活性,另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對擴(kuò)增較長的DNA段有利.各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。

二、PCR反應(yīng)參數(shù)

1. 變性：在*輪循環(huán)前,在94℃下變性5-10min非常重要,它可使模板DNA*解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復(fù)合物所造成的錯誤。變性不*,往往使PCR失敗,因為未變性*的DNA雙鏈會很快復(fù)性,減少DNA產(chǎn)量.一般變性溫度與時間為94℃ 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可*,所耗時間主要是為使反應(yīng)體系*達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟?。對于富?/span>GC的序列,可適當(dāng)提高變性溫度.但變性溫度過高或時間過長都會導(dǎo)致酶活性的損失。

2. 退火：引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度.實際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃。一般當(dāng)引物中GC含量高,長度長并與模板*配對時, 應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高, 所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個擴(kuò)增循環(huán), 既省時間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成,反應(yīng)中所需時間主要是為使整個反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。通常退火溫度和時間為37℃-55℃,1-2min。

3. 延伸：延伸反應(yīng)通常為72℃,接近于Taq DNA聚合酶的zui適反應(yīng)溫度75℃.實際上,引物延伸在退火時即已開始,因為Taq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應(yīng)時間的長短取決于目的序列的長度和濃度.在一般反應(yīng)體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。延伸時間過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加.但對很低濃度的目的序列, 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物, 這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。

4. 循環(huán)次數(shù)： 當(dāng)其它參數(shù)確定之后, 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30輪循環(huán)擴(kuò)增后, 反應(yīng)中Taq DNA聚合酶已經(jīng)不足, 如果此時產(chǎn)物量仍不夠, 需要進(jìn)一步擴(kuò)增, 可將擴(kuò)增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增, 這樣經(jīng)60輪循環(huán)后, 擴(kuò)增水平可達(dá)109-1010 。

擴(kuò)增產(chǎn)物的量還與擴(kuò)增效率有關(guān),擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:C=C0 (1+P)n 。其中：C為擴(kuò)增產(chǎn)物量,C0 為起始DNA量, P為增效率, n為循環(huán)次數(shù)。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。