一個完整的基因芯片實驗包括以下幾個步驟：研究課題的提出、芯片設(shè)計、樣品制備、雜交反應(yīng)、數(shù)據(jù)分析和處理。本文主要介紹其中的樣品制備(細胞標本采集和組織標本采集)的建議做法。
細胞標本采集操作建議規(guī)程
1. 所有樣品均應(yīng)有樣品標簽(注明樣品編號)，同時有一張樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等。
2. 一張芯片實驗一般要求細胞數(shù)在1E+08，建議設(shè)計實驗和收獲細胞時可考慮多收集一些。
3. 貼壁與懸浮細胞培養(yǎng)誘導(dǎo)結(jié)束后，去除培養(yǎng)液，保留的細胞用PBS緩沖液洗一下，除去緩沖液，加溶液D*充分溶解細胞，放入液氮運輸。樣品量以實際得到的total RNA為準。
4. 血液：將白細胞分離出來，加溶液D充分溶解細胞，放入液氮運輸。樣品量以實際得到的total RNA為準。
5. 如果是細胞未經(jīng)溶液D處理，直接凍入液氮罐(不)。工作人員會對細胞作相關(guān)處理，以便為細胞記數(shù)。
6. 以上提到的均是新鮮細胞，對一些已老化或質(zhì)量不明的細胞，工作人員有權(quán)提出疑義，并要求退回或重新取樣。
不同組織抽提3-10μg mRNA所需組織量
器官/組織* 提取3μgmRNA所需組織量(克) 提取10μgmRNA所需織量(克) 總RNA得率[單位:毫克RNA/克組織] mRNA所占百分比[%]
成人正常組織 肝 0.2083 0.6944 1.80 - 1.80 mg/g 0.80
成人正常組織 腦 缺數(shù)據(jù) 缺數(shù)據(jù) 1.30 - 1.30 mg/g 缺數(shù)據(jù)
成人正常組織 肺 0.3000 1.0000 1.00 - 1.00 mg/g 1.00
成人正常組織 心 0.5000 1.6667 0.60 - 0.60 mg/g 1.00
成人正常組織 胃 0.1852 0.6173 2.70 - 2.70 mg/g 0.60
成人正常組織 喉 0.3125 1.0417 1.20 - 1.20 mg/g 0.80
病理組織 結(jié)腸癌 0.2521 0.8403 1.70 - 1.70 mg/g 0.70
病理組織 胃癌 0.4317 1.4388 0.50 - 0.50 mg/g 1.39
病理組織 空腸腺癌 0.3571 1.1905 1.40 - 1.40 mg/g 0.60
病理組織 直腸癌 0.1604 0.5348 1.70 - 1.70 mg/g 1.10
病理組織 肝癌 0.1116 0.3720 3.84 - 3.84 mg/g 0.70
病理組織 肺癌 0.1282 0.4274 2.00 - 2.00 mg/g 1.17
考慮到個體差異以及樣品在研磨、勻漿等過程中的損失，客戶提供的樣品量應(yīng)在上述基礎(chǔ)上增加1-2倍。
組織標本采集操作建議規(guī)程
鋁箔 經(jīng)DEPC水浸泡過夜，78°C烘干，高壓滅菌后烘干
1.5 ml 微離心管
15 ml 聚丙烯離心管 市場有售RNAase-Free的相應(yīng)規(guī)格離心管
標簽紙
記號筆
樣品登記表 由客戶專人填寫
液氮罐 應(yīng)常備液氮罐，并保證液氮的來源
取材部位的病理切片 由客戶提供1-2張
注：
· 以下步驟1 - 5應(yīng)在冰上進行且不超過15分鐘，超過時間會導(dǎo)致樣品的RNA降解。
· 對腫瘤組織的取材，要求盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，例如對于手術(shù)切除的整個或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報告的結(jié)果來判定要進行研究的取材部位。
1. 離體新鮮組織，切成多個1cm3小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜;肝、腎、脾應(yīng)剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈(正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈)。
2. 在RNase-Free 0.9%生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。
3. 用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織(但統(tǒng)一采用鋁箔)。用記號筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號，并貼上標簽，迅速投入液氮冷卻。
4. 填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等 。
5. 將液氮冷卻的組織放入樣品袋(每個樣品袋只保存同樣的組織)，袋口留一根編號繩，繩上粘一張標簽紙(標簽上注明：樣品名稱、編號、日期)，迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐。
6. 保留1-2張取材部位的病理切片。
基因芯片樣品的制備要點：
1.目的DNA的選擇對于大規(guī)模地研究基因表達問題，需要分析每一個基因的表達。因此，選擇的目的DNA必須能夠代表要研究的各個基因。對于整個基因組序列全部已知的生物，zui直接的方法是用PCR擴增基因組中每個已知的或預(yù)測的開放閱讀框架(openreadingframe)，亦可以選擇自己感興趣的部分序列。對于沒有測序，或只有部分測序的基因組，或者對于那些有大量內(nèi)含子的基因組，上述方法就不現(xiàn)實。在這種情況下，我們首先考慮采用表達序列標記(EsT)?？梢詫蝹€EST的cD一NA克隆用作陣列DNA來源。對于還沒有基因組測序計劃或序列還未知的生物，可以利用cDNA文庫作為DNA來源。當然這種文庫是經(jīng)歸整化處理過，以減少不必要的冗余。
用作陣列的DNA可以是雙鏈的，亦可以是單鏈的。但是其長度是小于開放閱讀框架，或小于1000bp的cDNA。這對于很多具有同源性的基因尤為重要。當基因之間具有很高同源性時，選擇基因之間有差異的部分，這樣便可以提高基因之間的分辨度。所以，在考慮每個基因代表性的同時，應(yīng)充分考慮所研究問題的具體情況。
2.pcR擴增一般而言，100uLIPCR反應(yīng)體系得到的產(chǎn)物足以點印：000個基因芯片。PcR通常是在96孔PCR儀上進行擴增。實際擴增的反應(yīng)條件要根據(jù)所用的模板及引物來確定。但要盡量減少PCR反應(yīng)體系中的組分，盡量只用模板、引物、核昔酸、Mg標準緩沖液和酶。不要用甘油或明膠，它們往往會粘附在陣列塊上而影響以后的點樣工作。
3.點樣前DNA準備點樣以前，要將pcR產(chǎn)物清洗純化干凈，并且對DNA進行一些處理，一般用異丙醇沉淀PCR產(chǎn)物，以除去酶、離子及核昔酸等。沉淀后用70%乙醇院1次，再用95%乙醇洗1次，待*干燥后，將所沉淀DNA重溶在3xSSC中，其濃度掌握在100ny…左右、由于處理的樣本量很大，一般直接在96孔板上直接操作，可選用能夠配置96孔板的離心機(如SavantSpeedVacPlussC210A)。當把DNA溶于10～15tL13XSSC(pH7.0)中后，置于4”C至少12h。然后，將DNA溶液封存在一20C～4”C。
除極個別特殊的樣品外，大多數(shù)的生物樣品不能與基因芯片反應(yīng)。對此，應(yīng)該對樣品進行提取擴增獲取其中的目的蛋白質(zhì)或基因，然后標記，可提高檢測的靈敏度和實驗操作人員的安全性。
