*部分
一、 基本步驟：
1、目的基因(DNA和mrna)的查找和比對(duì);
2、引物、探針的設(shè)計(jì);
3、引物探針的合成;
4、反應(yīng)體系的配制;
5、反應(yīng)條件的設(shè)定;
6、反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化;
7、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析;
8、標(biāo)準(zhǔn)品的制備;
二、技術(shù)關(guān)鍵：
1、 目的基因(DNA和mRNA)的查找和比對(duì);
從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)點(diǎn)的genbank中下載所需要的序列。下載的方式有兩種：一為打開(kāi)某個(gè)序列后，直接點(diǎn)擊“save”，保存格式為“.txt”文件。保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊(cè)號(hào)。然后，再打開(kāi)DNAstar軟件中的Editseq軟件，點(diǎn)擊“file”菜單中的“import”，打開(kāi)后點(diǎn)擊“save”，保存為“.seq”文件。另一種直接用DNAstar軟件中的Editseq軟件，點(diǎn)擊“file”菜單中的“open entrez sequence”，導(dǎo)入后保存為“.seq”文件，保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊(cè)號(hào)。然后要對(duì)所有的序列進(jìn)行排序。用DNAstar軟件中的Seqman軟件，點(diǎn)擊“sequence”菜單中的“add”，選擇要比較的“.seq”的所有文件，點(diǎn)擊“add” 或“add all”，然后點(diǎn)擊“Done”導(dǎo)入要比較的序列，再點(diǎn)擊“assemble”進(jìn)行比較。橫線的上列為一致性序列，所有紅色的堿基是不同的序列，一致的序列用黑色堿基表示。有時(shí)要設(shè)定比較序列的開(kāi)始與結(jié)尾。有時(shí)因?yàn)閰?shù)設(shè)置的原因，可能分為幾組(contig)，若想全部放在一組中進(jìn)行比較，就調(diào)整“project” 菜單下的“parameter”，在“assembling”內(nèi)的“minimum math percentage”默認(rèn)設(shè)置為80，可調(diào)低即可。再選擇幾個(gè)組，點(diǎn)擊“contig”菜單下的“reassemble contig”即可。選擇高低的原則是在保證所分析的序列在一個(gè)“contig”內(nèi)的前提下，盡量提高“minimum math percentage”的值。有時(shí)因此個(gè)別序列原因，會(huì)出現(xiàn)重復(fù)序列，堿基的缺失或插入，要對(duì)“contig”的序列的排列進(jìn)行修改，確保排列是每個(gè)序列的真實(shí)且排列同源性的排列。然后，點(diǎn)擊“save”保存即可。分析時(shí)，主要是觀察是否全部為一致性的黑色或紅色，對(duì)于彌散性的紅色是不可用的。
2、 引物和探針設(shè)計(jì)
2.1引物設(shè)計(jì)
細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR中zui重要的一步。理想的引物對(duì)只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會(huì)同擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個(gè)可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點(diǎn)：
²序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段;
²擴(kuò)增片段長(zhǎng)度根據(jù)技術(shù)的不同有所分別：
sybr green I技術(shù)對(duì)片段長(zhǎng)度沒(méi)有特殊要求;
Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在50bp-150bp;
²避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì);
²避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu);
²典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%;
²引物之間的TM相差避免超過(guò)2℃;
²引物的3’端避免使用堿基A;
²引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基。
²為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)能跨兩個(gè)外顯子。