蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其它生命學(xué)科zui常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測的重要指標(biāo)。在生化實(shí)驗(yàn)中，對樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進(jìn)行的一項(xiàng)非常重要的工作。
蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的種類很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法代來了許多具體的困難。目前測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測定方法：
物理性質(zhì)：紫外分光光度法
化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法，BCA法，膠體金法
染色性質(zhì)：考馬氏亮藍(lán)染色法、銀染法
其他性質(zhì)：熒光法
蛋白質(zhì)測定的方法很多，但每種方法都有其特點(diǎn)和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒?，以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果zui，但操作復(fù)雜，用于大批量樣品的測試則不太合格；雙縮脲法操作簡單，線性關(guān)系好，但靈敏度差，樣品需要量大，測量范圍窄，因此在科研上的應(yīng)用受到限制；而酚試劑法彌補(bǔ)了它的缺點(diǎn)，因而在科研中被廣泛采用，但是它的干擾因素多；考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而又簡便開始重新受到關(guān)注；BCA法又以其試劑穩(wěn)定，抗力較強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受到歡迎；膠體金法具有較高的靈敏度，可達(dá)到毫微克水平，用于微量蛋白的測定。

常用的測定蛋白質(zhì)含量方法的比較
 

方 法

測定范圍

（μg/ml）

不同種類

蛋白的差異

zui大吸收

波長（nm）

特 點(diǎn)

凱氏定氮法

小

標(biāo)準(zhǔn)方法，準(zhǔn)確，操作麻煩，費(fèi)時(shí)，靈敏度低，適用于標(biāo)準(zhǔn)的測定

紫外分光光度法

100—1000

大

280
205

靈敏，快速，不消耗樣品，核酸類物質(zhì)有影響

雙縮脲法

1000—10000

小

540

重復(fù)性、線性關(guān)系好，靈敏度低，測定范圍窄，樣品需要量大

Folin-酚試劑法

20—500

大

750

靈敏，費(fèi)時(shí)較長，干擾物質(zhì)多

考馬氏亮藍(lán)G-250

50—500

大

595

靈敏度高，穩(wěn)定，誤差較大，顏色會(huì)轉(zhuǎn)移

BCA

50—500

大

562

靈敏度高，穩(wěn)定，干擾因素少，費(fèi)時(shí)較長 由于凱氏定氮法的操作作過于復(fù)雜，雙縮脲法的靈敏度又太低，下面介紹Folin—酚試劑法，考馬氏亮藍(lán)G—250染色法，紫外分光光度法、膠體金法等幾種zui常用使用的方法。

一、Folin－酚試劑法（又名Lowry）法
目前實(shí)驗(yàn)室較多用用Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量，此法的特點(diǎn)是靈敏度高，較雙縮脲高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應(yīng)約在15分鐘有zui大顯色，并zui少可穩(wěn)定幾個(gè)小時(shí)，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質(zhì)都會(huì)影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【原 理】
蛋白質(zhì)中含有酚基的，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產(chǎn)生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白含量成正比。
【操 作】
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：
按下表操作，在試管中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用生理鹽水補(bǔ)足到1ml。加入5ml的堿性酮試劑，混勻后室溫放置20分鐘后，再加入0.5ml酚試劑混勻。
編 號(hào) 1 2 3 4 5 6 蛋白標(biāo)準(zhǔn)（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.9% NaCl（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 堿性酮試劑（ml） 5 5 5 5 5 5 混勻后室溫（25℃）放置20分鐘 酚試劑（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 30分鐘后，以第1管為空白，在650nm波長比色，讀出吸光度，以各客的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、血清蛋白質(zhì)測定。
稀釋血清（或其它蛋白樣品濃度）：準(zhǔn)確吸取0.1ml血清，置于50ml容量瓶中，用生理鹽水釋釋至刻度（此為稀釋500倍，其它蛋白樣品酌情而定）。再取三只試管，分別標(biāo)以1、2、3號(hào)，按下表操作：
編 號(hào) 測定管 標(biāo)準(zhǔn)管 空白管 稀釋標(biāo)本（ml） 0.2 — — 稀釋標(biāo)準(zhǔn)液（ml） — 0.2 — 0.9%NaCl（ml） — — 0.2 堿性酮液（ml） 1.0 1.0 1.0 混勻后于室溫放置20分鐘 酚試劑（ml） 0.1 0.1 0.1

混勻各管，30分鐘后，在波長650nm比色，讀取吸光度。
【計(jì) 算】
1、以測定管讀數(shù)查找標(biāo)準(zhǔn)曲線求得血清蛋白含量。
2、無標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，可以與測定管同樣操作的標(biāo)準(zhǔn)管按下式計(jì)算蛋白含量：