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實時熒光定量PCR實驗體系的設(shè)計與優(yōu)化

時間:2016-3-23閱讀:787
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時熒光定量PCR以其、快速、方便,越來越多的應(yīng)用在科研、臨床及檢驗檢疫的各個領(lǐng)域。但是定量PCR是對性要求很高的實驗,不僅要求在實驗前有比較完整的實驗設(shè)計方案,而且實驗的條件對實驗結(jié)果的影響也非常大。這些都是很多老師與學生非常關(guān)心的問題,下面分別從這兩個方面來對定量PCR實驗做一些闡述。 
定量pcr實驗步驟(以mRNA為例): 
1.設(shè)計實驗方案:例如對樣品、實驗組和對照組的一個實驗流程設(shè)計 
2.引物和探針的設(shè)計和合成 
3.抽提RNA,測定提取的RNA的濃度 
4.反轉(zhuǎn)錄PCR 
5.定量PCR 
6.數(shù)據(jù)分析 
在進行定量PCR實驗的過程中,PCR的擴增效率是一個非常重要的影響因素,因為定量PCR原理的理論方程是基于擴增效率zui大值1,因此高的擴增效率能保證定量PCR實驗的性及重復性,影響PCR擴增效率主要有以下幾個方面:1,擴增子的長度;2,擴增子的GC含量;3,擴增子、引物和探針的二級結(jié)構(gòu);4,PCR反應(yīng)各組分的濃度;5,RNA或者cDNA的純度。 
進行定量PCR實驗時,必須設(shè)計好引物和探針,除了能獲得高的擴增效率外,對PCR擴增的特異性、消除基因組DNA的擴增及提高擴增的靈敏度都有很大的影響。下圖就是使用不同的引物和探針對18SRNA進行定量PCR的熒光曲線圖(反應(yīng)條件和模板都相同)。

實時熒光定量PCR實驗體系的設(shè)計與優(yōu)化

探針設(shè)計的基本原則:
1. 保守:探針要的保守,有時分型就僅僅依靠探針來決定。理論上有一個堿基不配對,就可能檢測不出來。

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