本方法由Dellaporta,Wood和Hicks(1983)的方法修改而成。其基本原理是研磨的組織細(xì)胞用熱的SDS裂解后,加入高濃度的KAc,0℃放置以除去蛋白和多糖類雜質(zhì),zui后用乙醇或異丙醇沉淀。
一 材料、試劑和儀器
1 材料 新鮮的組織材料或-80℃凍存的材料
2 試劑
(1)提取緩沖液
Tris-HCl 100mmol/L(pH8.0)
EDTA 50mmol/L (pH8.0)
NaCl 500 mmol/L
滅菌后加β-巰基乙醇至10 mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高鹽溶液5mol/L KAc
(4) RNAseA 10mg/ml
(5) 異丙醇
(6)滅菌ddH2O或TE
3. 儀器: 離心機(jī), 恒溫水浴, 臺(tái)式高速離心機(jī),電泳裝置
二 實(shí)驗(yàn)程序
1取幼嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈,再用滅菌ddH2O沖洗2次,放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中,加入液氮研磨至粉末狀,用干凈的滅菌不銹鋼勺轉(zhuǎn)移粉末到加有500μL提取液的離心管中,輕輕混勻。
2 向管中加入50μL20%SDS溶液,混勻,不可過于強(qiáng)烈震蕩以防基因組DNA斷裂 ,65℃保溫10min,并不時(shí)搖動(dòng)。
3 加入150μL 5mol/L KAc,混勻,置冰上20-30 min。
4 4℃,15 000rpm離心15min,轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中,加入0.7V的異丙醇,混勻,-20℃沉淀30 min 。
5 12 000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀,吹干后加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。
6 加入1/10體積的RNaseA,37℃保溫20min,除去RNA。
7 CI抽提后,加2V乙醇,-20℃沉淀30 min 。12 000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀。
8 用400μL 70%乙醇洗一次后,吹干,加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。
9 電泳檢測(cè)完整性。
三、結(jié)果分析
1. 用紫外分光光度計(jì)在230nm、260nm、 280nm和310nm波長分別讀數(shù)。其中260nm
用瓊脂糖凝膠電泳(0.8%)檢測(cè)核DNA的完整性(見圖2 )。
完整性好的基因組DNA應(yīng)是一條比23Kb滯后的電泳帶, 若降解則成為彌散狀。
電泳前緣為未除干凈的RNA。
2.如果DNA沉淀呈白色透明狀而且溶解后成粘稠狀,說明DNA含有較多的多糖類物質(zhì),可以在取材前將植物放暗處24hr,以達(dá)到去除淀粉的目的。
3. DNA沉淀呈棕色,難以酶切
植物材料含有大量酚類化合物,與DNA共價(jià)結(jié)合,使DNA呈棕色,并抑制DNA的酶解反應(yīng)。為防止此情況出現(xiàn),可在加入2 ×CTAB的同時(shí)加入2-5%的巰基乙醇,或者加入亞精胺(100μl DNA加5μl 0.1mol/L的亞精胺)。
4.DNA中含有多糖或鹽類
將DNA用乙醇或異丙醇沉淀出來,離心,沉淀用70%乙醇清洗兩次或更多次,吹干后重溶于TE中。(注意乙醇一定要吹干, 否則電泳點(diǎn)樣時(shí), 樣品上漂)
5.DNA已降解電泳條帶呈彌散狀
樣品降解可能有兩種情況:一是機(jī)械振動(dòng)過劇烈,二是操作過程中DNase污染。在提取DNA的各個(gè)操作過程中要避免劇烈振蕩,提取液及用品要高溫高壓滅菌。另外,使用Tip頭吸取過程中應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,Tip頭應(yīng)剪去Tip頭尖,避免反復(fù)凍融DNA。