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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
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Feulgen反應(yīng)原理及Sohiff液的配制

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Feulgen 反應(yīng)原理及 Sohiff 液的配制

 

    Feulgen 反應(yīng)是顯示DNA的經(jīng)典而特異的染色方法,由Feulgen(孚爾根)在1924年提出,因而得名。

(一)Feulgen反應(yīng)原理

    DNA 可在酸性條件下水解,嘌呤―脫氧核糖之間的糖苷鍵斷開,形成醛基(―CHO),再用  顯示醛基的特異性試劑Schiff試劑處理,形成光鏡下所見的細(xì)胞核內(nèi)紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。DNA  經(jīng)處理而水解。除可破壞脫氧核糖與嘌呤堿外,還可水解嘧啶堿。酸水解核酸的程度與  水解時(shí)間長短有關(guān),隨著水解時(shí)間的延長,嘌呤堿基增多,形成的醛基也隨之增多,F(xiàn)eulgen反應(yīng)加強(qiáng)。如果水解時(shí)間過長,DNA將*水解,反而使Feulgen反應(yīng)減弱。DNA水解時(shí)間因組織種類和固定液不同而異,需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)找到合適的水解溫度和時(shí)間。由于Schiff試劑能與醛基結(jié)合,故不能用含醛的固定液固定組織,常用Carnoy固定液。Bouin液不適用于Feulgen反應(yīng),因?yàn)楣潭ㄒ褐泻^多的酸,可將DNA水解,影響染色反應(yīng)。

    Schiff試劑是顯示醛基的特異試劑,其反應(yīng)原理是堿性品紅(為紅紫色)經(jīng)亞硫酸處理后變?yōu)槲迳玈chiff液,Schiff液遇到醛基時(shí),則被還原形成原有的顏色,即紅紫色。堿性品紅結(jié)構(gòu)中的醌基是堿性品紅中具有紫紅色的核心結(jié)構(gòu),經(jīng)亞硫酸處理后,則醌基兩端的雙鍵打開,形成五色品ii-硫酸復(fù)合物為Schiff試劑。如果加熱使SO2逸出,則恢復(fù)品紅原來的顏色而失去對DNA的染色效果,故配好的Schiff試劑應(yīng)避免SO2 逸出。

Feulgen反應(yīng)原理

(二)Sohiff液的配制

    將lg堿性品紅溶于200ml煮沸的蒸餾水中,使其*溶解,然后冷卻到60℃過濾。加入30ml 1N HCl和3g焦亞硫酸鉀(K:S:();)或亞硫酸鈉,塞緊瓶塞,置于暗處或外包黑紙24小時(shí)。1N HCl與焦亞硫酸鹽生成的SO:將溶液中堿性品紅脫色成為無色堿性品紅(即白亞磺酸)。如溶液尚有淺黃色,可用0.5g活性炭脫色,搖動幾分鐘后迅速用粗濾紙過濾.濾液應(yīng)為清亮五色。制成的Schiff試劑應(yīng)置于棕色瓶中,瓶塞需擰緊并用黑紙包裹,避光保存于4℃,保質(zhì)期可達(dá)半年。若暴露于空氣,或加熱則使Schiff試劑中的S02 逸出,變性的Schiff試劑則不能使用。除堿性品紅外。其他堿性染料也可制成能與醛基反應(yīng)的類似Schie  反應(yīng)液,但是。不能達(dá)到五色。在染色時(shí)可用l%鹽酸乙醇洗去不起反應(yīng)的余色。Schiff試劑在不同的pH條件下可顯示不同的物質(zhì),如Sehiff試劑在pH 3.0~4.3時(shí),對Feulgen反應(yīng)效果好,而pH 2.4時(shí),對PAS(糖原)反應(yīng)效果好。

    注意:Schiff試劑雖無色,但氧化后為紫紅色。同時(shí)要防止污染環(huán)境,用后要回收。

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