一、限制與修飾（Restriction and modification）

1.限制與修飾現(xiàn)象

早在 50 年代初，有許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)了限制與修飾現(xiàn)象，當(dāng)時(shí)稱作寄主控制的專一性（host controlled specificity）。 l 噬菌體表現(xiàn)的現(xiàn)象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率可說(shuō)明這一問(wèn)題（表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時(shí)會(huì)受到限制。

E.coli 菌株 λ噬菌體感染率 

lK lB lC 

E.coli K 1 10-4 10-4 

E.coli B 10-4 1 10-4 

E.coli C 1 1 1 

說(shuō)明 K 和 B 菌株中存在一種限制系統(tǒng)，可排除外來(lái)的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果，此時(shí)限制系統(tǒng)還未起作用。而在 C 菌株不能限制來(lái)自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用實(shí)際就是限制酶降解外源 DNA ，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤 A 成為 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成為 5' 甲基胞嘧啶。通過(guò)甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來(lái)遺傳物質(zhì)的目的。2.限制酶的發(fā)現(xiàn)

在 20 世紀(jì) 60 年代，人們就注意到 DNA 在感染宿主后會(huì)被降解的現(xiàn)象，從而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，從 E.coli K 中分離到限制酶，它有特定的識(shí)別位點(diǎn)但沒有特定的切割位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)離識(shí)別位點(diǎn)達(dá) 1000bp 以上。

1970 年，美國(guó)約翰·霍布金斯大學(xué)的 H. Smith 于偶然中發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌體 DNA ，其細(xì)胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，從而找到 HindⅡ 限制性內(nèi)切酶。 HindⅡ 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和切割位點(diǎn)如下：

5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '

3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '

從此以后，發(fā)現(xiàn)的限制酶越來(lái)越多，并且許多已經(jīng)在實(shí)踐中得到應(yīng)用。 EcoRⅠ 是應(yīng)用zui廣泛的限制性內(nèi)切酶，酶切位點(diǎn)和切割位點(diǎn)如下：

5' G↓AATTC 3'

3' CTTAA↑G 5'

限制性內(nèi)切酶的命名遵循一定的原則，主要依據(jù)來(lái)源來(lái)定，涉及宿主的種名、菌株號(hào)或生物型。命名時(shí)，依次取宿主屬名*字母，種名頭兩個(gè)字母，菌株號(hào)，然后再加上序號(hào)（羅馬字）。如 HindⅢ 限制性內(nèi)切酶， Hin 指來(lái)源于流感嗜血桿菌， d 表示來(lái)自菌株 Rd ， Ⅲ 表示序號(hào)。以前在限制性內(nèi)切酶和修飾酶前加 R 或 M ，且菌株號(hào)和序號(hào)小寫。但現(xiàn)在限制性內(nèi)切酶名稱中的 R 省略不寫。

1986 年下半年發(fā)現(xiàn) 615 種限制酶和 98 種甲基化酶; 1998 年發(fā)現(xiàn) 10000 種細(xì)菌或古細(xì)菌中存在 3000 種酶，且酶有 200 多種特異性。到 2005 年 1 月，共發(fā)現(xiàn) 4342 種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 種，包括 Ⅰ 型、 Ⅱ 型、 Ⅲ 型限制酶各有 59 、3612 、10 種，甲基化指導(dǎo)的限制酶有 3 種，商業(yè)化的限制酶有 588 種，在 Ⅱ 型限制酶中共有 221 種特異性。

3.限制與修飾系統(tǒng)的種類

根據(jù)酶的亞單位組成、識(shí)別序列的種類和是否需要輔助因子，限制與修飾系統(tǒng)至少可分為四類。表 2-2 是各種限制與修飾系統(tǒng)的比較。

Ⅱ 型（type Ⅱ）限制與修飾系統(tǒng)所占的比例zui大，達(dá) 93% 。 Ⅱ 型酶相對(duì)來(lái)說(shuō)zui簡(jiǎn)單，它們識(shí)別回文對(duì)稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割 DNA ，產(chǎn)生帶 3'- 羥基和 5'- 磷酸基團(tuán)的 DNA 產(chǎn)物，需 Mg2+ 的存在才能發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需 SAM 。識(shí)別序列主要為 4-6bp ，或更長(zhǎng)且呈二重對(duì)稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列，切割位置因酶而異，有些是隔開的。

Ⅱs 型（type Ⅱs）限制與修飾系統(tǒng)，占 5% ，與 Ⅱ 型具有相似的輔因子要求，但識(shí)別位點(diǎn)是非對(duì)稱，也是非間斷的，長(zhǎng)度為 4-7bp ，切割位點(diǎn)可能在識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的 20bp 范圍內(nèi)。

Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚體（homodimer），由兩個(gè)彼此按相反方向結(jié)合在一起的相同亞單位組成，每個(gè)亞單位作用在 DNA 鏈的兩個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)上。修飾酶是單體，修飾作用一般由兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)完成，分別作用于其中一條鏈，但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的。

在 Ⅱ 型限制酶中還有一類特殊的類型，該酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈，造成一個(gè)切口，這類限制酶也稱切口酶 （nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。

Ⅰ 型（type Ⅰ）限制與修飾系統(tǒng)的種類很少，只占 1% ，如 EcoK 和 EcoB 。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亞基和 M 亞基） 各作為一個(gè)亞基存在于酶分子中，另外還有負(fù)責(zé)識(shí)別 DNA 序列的 S 亞基，分別由 hsdR 、hsdM 和 hsdS 基因編碼，屬于同一操縱子（轉(zhuǎn)錄單位）。 EcoK 編碼基因的結(jié)構(gòu)為 R2M2S 。 EcoB 編碼基因的結(jié)構(gòu)為 R2M4S2 。

EcoB 酶的識(shí)別位點(diǎn)如下，其中兩條鏈中的 A 為甲基化位點(diǎn)， N 表示任意堿基。

TGA*（N）8TGCT

EcoK 酶的識(shí)別位點(diǎn)如下，其中兩條鏈中的 A 為可能的甲基化位點(diǎn)。

AA°C（N）6GTGC

但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn) 1000bp 以外，且無(wú)特異性。

Ⅲ 型（type Ⅲ）限制與修飾系統(tǒng)的種類更少，所占比例不到 1% ，如 EcoP1 和 EcoP15 。它們的識(shí)別位點(diǎn)分別是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位點(diǎn)則在下游 24-26bp 處。

在基因操作中，一般所說(shuō)的限制酶或修飾酶，除非特指，均指 Ⅱ 型系統(tǒng)中的種類。

表2-2：各種限制與修飾系統(tǒng)的比較

 Ⅱ Ⅰ Ⅲ 

酶分子 內(nèi)切酶與甲基化酶

分子不在一起 三亞基雙功能酶 二亞基雙功能酶 

識(shí)別位點(diǎn) 4-6bp, 大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu) 二分非對(duì)稱 5-7bp 非對(duì)稱 

切割位點(diǎn) 在識(shí)別位點(diǎn)中或靠近識(shí)別位點(diǎn) 無(wú)特異性，至少在識(shí)別位點(diǎn)外 1000bp 在識(shí)別位點(diǎn)下游 24-26bp 

限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng) 分開的反應(yīng) 互斥 同時(shí)競(jìng)爭(zhēng) 

限制作用是否需用 ATP No Yes Yes 

二、限制酶識(shí)別的序列

1.限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度

限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度一般為 4-8 個(gè)堿基，zui常見的為 6 個(gè)堿基（表2-3）。當(dāng)識(shí)別序列為 4 個(gè)和 6 個(gè)堿基時(shí)，它們可識(shí)別的序列在*隨機(jī)的情況下，平均每 256 個(gè)和 4096 個(gè)堿基中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)（44=256，46=4096）。以下是幾個(gè)有代表性的種類，箭頭指切割位置。

4 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：Sau3AⅠ ↓GATC

5 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoRⅡ ↓CCWGG

NciⅠ CC↓SGG

6 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoRⅠ G↓AATTC

HindⅢ A↓AGCTT

7 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：BbvCⅠ CC↓TCAGC

PpuMⅠ RG↓GWCCY

8 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：NotⅠ GC↓GGCCGC

SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC

以上序列中部分字母代表的堿基如下。

R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C

K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T

H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G

D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T

2.限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)

限制酶識(shí)別的序列大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，切割位點(diǎn)在 DNA 兩條鏈相對(duì)稱的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的識(shí)別序列和切割位置如下。

EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT

CTTAA↑G TTCGA↑A

有一些限制酶的識(shí)別序列不是對(duì)稱的，如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。識(shí)別序列后面括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示在兩條鏈上的切割位置。

AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG

GGC↑GAG GAGCA↑C

有一些限制酶可識(shí)別多種序列，如 AccⅠ 識(shí)別的序列是 GT↓MKAC ，也就是說(shuō)可識(shí)別 4 種序列，其中兩種是對(duì)稱的，另兩種是非對(duì)稱的。 HindⅡ 識(shí)別的序列是 GTY↓RAC 。

有一些限制酶識(shí)別的序列呈間斷對(duì)稱，對(duì)稱序列之間含有若干個(gè)任意堿基。如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ，它們的識(shí)別序列如下。

AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG

GT↑CNNNGAC GANT↑C

3.限制酶切割的位置

限制酶對(duì) DNA 的切割位置大多數(shù)在內(nèi)部，但也有在外部的。在外部的，又有兩端、兩側(cè)和單側(cè)之別。切點(diǎn)在兩端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等;在兩側(cè)的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ（CASTGNN↓）， BcgⅠ 酶的切割特性與其它酶不同，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)的兩端各切開一個(gè)斷點(diǎn)，而不是只產(chǎn)生一個(gè)斷點(diǎn)。切點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)外側(cè)的還有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。

BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓

↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ ↑NNGTG（C）ACNN

三、限制酶產(chǎn)生的末端

1.限制酶產(chǎn)生匹配粘端（matched ends）

識(shí)別位點(diǎn)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的末端為匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），這樣形成的兩個(gè)末端是相同的，也是互補(bǔ)的。若在對(duì)稱軸 5' 側(cè)切割底物， DNA 雙鏈交錯(cuò)斷開產(chǎn)生 5' 突出粘性末端，如 EcoRⅠ ;若在 3'-側(cè)切割，則產(chǎn)生 3' 突出粘性末端，如 KpnⅠ 。

NNG↓AATTCNN EcoRⅠ NNG AATTCNN

NNCTTAA↑GNN NNCTTAA GNN

2.限制酶產(chǎn)生平末端（Blunt end）

在回文對(duì)稱軸上同時(shí)切割 DNA 的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端，如 HaeⅢ（GG↓CC）和 EcoRV（GAT↓ATC）。產(chǎn)生平末端的 DNA 可任意連接，但連接效率較粘性末端低。

3.限制酶產(chǎn)生非對(duì)稱突出端

許多限制酶切割 DNA 產(chǎn)生非對(duì)稱突出端。當(dāng)識(shí)別序列為非對(duì)稱序列時(shí)，切割的 DNA 產(chǎn)物的末端是不同的，如 BbvCⅠ ，它的識(shí)別切割位點(diǎn)如下。

CC↓TCAGC

GGAGT↑CG

有些限制酶識(shí)別簡(jiǎn)并序列，其識(shí)別的序列中有幾種是非對(duì)稱的。如 AccⅠ ，它的識(shí)別切割位點(diǎn)如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 為非對(duì)稱。

GT↓AT/CGAC

CATA/GC↑TG

有些限制酶識(shí)別間隔序列，間隔區(qū)域的序列是任意的，如 DraⅢ 和 EarⅠ

4.同裂酶（isoschizomer）

識(shí)別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點(diǎn)可能不同。具體可分為以下幾種情況。

① 同序同切酶 這些酶識(shí)別序列和切割位置都相同，如 HindⅡ 與 HincⅡ 識(shí)別切割位點(diǎn)為 GTY↓RAC ， HpaⅡ 與 HapⅡ 識(shí)別切割位點(diǎn)為 C↓CGG ， MobⅠ 與 Sau3AⅠ 識(shí)別切割位點(diǎn)為 ↓GATC 。

② 同序異切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 識(shí)別的序列是相同的，但它們的切割位點(diǎn)不同，分別為 GGTAC↓C 和 G↓GTACC 。另外， Asp718Ⅰ 識(shí)別和切割位點(diǎn)為 G↓GTACC 。

③“同功多位”許多識(shí)別簡(jiǎn)并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。如 EcoRⅠ 識(shí)別和切割位點(diǎn)為 G↓AATTC ， ApoⅠ 識(shí)別和切割位點(diǎn)為 R↓AATTY ，后者可識(shí)別前者的序列。另外， HpaⅠ 和 HincⅡ 的識(shí)別位點(diǎn)也有交叉，它們的識(shí)別和切割位點(diǎn)分別為 GTT↓AAC 和 HincⅡ 。

④ 其它有些限制酶識(shí)別的序列有交叉，如在 pUC 系列質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中有一個(gè) SalⅠ 位點(diǎn)（識(shí)別切割位點(diǎn)為 G↓TCGAC），該位點(diǎn)也可被 AccⅠ（識(shí)別切割位點(diǎn)為 GT↓MKAC）和 HincⅡ（識(shí)別切割位點(diǎn)為 GTY↓RAC）切割。

5.同尾酶

許多不同的限制酶切割 DNA 產(chǎn)生的末端是相同的，且是對(duì)稱的，即它們可產(chǎn)生相同的粘性突出末端。這些酶統(tǒng)稱為同尾酶。這些酶切割 DNA 得到的產(chǎn)物可進(jìn)行粘端連接。以下幾種酶產(chǎn)生的末端是相同的。通過(guò)表 4-3 很容易判斷哪些酶可產(chǎn)生相同的 DNA 末端。

·EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY

·SpeⅠ A↓CTAGT NheⅠ G↓CTAGC XbaⅠ T↓CTAGA

·BamHⅠ G↓GATCC Sau3AⅠ ↓GATC StyⅠ C↓CWWGG

·ClaⅠ AT↓CGAT AccⅠ GT↓MKAC （pUC19）

6.識(shí)別特殊系列的 I-prefix 和 pI-prefix 系列酶

有些線粒體、葉綠體、核 DNA 、T 偶數(shù)噬菌體含有一些編碼內(nèi)切酶的內(nèi)含子，有些 intein （protein splicing element） 也有內(nèi)切酶的活性，這兩類內(nèi)切核酸酶稱為 I-prefix 和 pI-prefix 系列內(nèi)切酶，它們識(shí)別的序列很長(zhǎng)。 I-prefix 是由在 RNA 水平上剪切和編碼的， pI-prefix 在蛋白質(zhì)水平上剪切的產(chǎn)物。這類內(nèi)切酶也稱為 homing endonuclease ，目前商業(yè)化的種類有 6 種。從因特網(wǎng)上可以找到 Intein 的數(shù)據(jù)庫(kù) Inbase（Intein Database），該由 New England BioLabs 公司維護(hù)（http://www.neb.com）。

I-CeuI 酶是衣滴蟲（Chlamydomonas eugametos）葉綠體大 rRNA 基因的內(nèi)含子編碼的產(chǎn)物，識(shí)別位點(diǎn)為 26bp ，識(shí)別的核心部位為 -12 至 +7 位置的 19bp 。反應(yīng)溫度為 37℃ ，識(shí)別位點(diǎn)如下，方框內(nèi)為核心識(shí)別序列。

TAACTATAACGGTC↑CTAA↓GGCA

四、DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響

限制酶切割 DNA 時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度的要求，也就是說(shuō)在識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。

用 20 單位（Units）限制酶切割 1mg 標(biāo)記的寡核苷酸做測(cè)試時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同的酶對(duì)識(shí)別序列兩端的長(zhǎng)度有不同的要求（表 2-4）。相對(duì)來(lái)說(shuō)， EcoRⅠ 對(duì)兩端的序列長(zhǎng)度要求較小，在識(shí)別序列外側(cè)有一個(gè)堿基對(duì)時(shí)在 2 小時(shí)的切割活性可達(dá) 90% 。而 AccⅠ 和 HindⅢ 對(duì)兩端的序列長(zhǎng)度要求較大。

表2-4：靠近DNA，片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測(cè)） 

限制酶 待測(cè)的寡核苷酸序列 待測(cè)的寡核苷酸序列 

2hr 20hr 

AccⅠ CCGGTCGACCGG 0 0 

HindⅢ CAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG 0

0

10 0

0

75 

EcoRⅠ GGAATTCC >90 >90 

PstⅠ GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）20 0

10

>90

0 0

10

>90

0 

用 DNA 片段（線性載體）檢測(cè)末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)識(shí)別序列的末端長(zhǎng)度對(duì)酶切效率有明顯影響，不同的酶對(duì)末端長(zhǎng)度的要求是不同。

在設(shè)計(jì) PCR 引物時(shí)，如果要在末端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，為保證能夠順利切割擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計(jì)的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。另外，了解末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點(diǎn)時(shí)選擇酶切秩序。

五、位點(diǎn)偏愛（Site preference）

某些限制酶對(duì)同一介質(zhì)中的有些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛性切割，即對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛。

某些噬菌體 DNA 中的某些相同的酶切位點(diǎn)對(duì)酶的敏感性是不同。λ 噬菌體 DNA 為 48502bp ，含 12bp 粘端。 EcoRⅠ 酶切割 l 噬菌體中的 5 個(gè)位點(diǎn)時(shí)并不是隨機(jī)的，靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快 10 倍; EcoRⅠ 對(duì)腺病毒 2（adenvirus-2）DNA 不同位置切點(diǎn)的切割速率也不同。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 在 l 噬菌體 DNA 中的切割速率分別有 10 倍和 14 倍的差異。 l 噬菌體 DNA 有 4 個(gè) SacⅡ 位點(diǎn)，三個(gè)在，一個(gè)在右臂，對(duì)三個(gè)位點(diǎn)的酶切速度快 50 倍。在 φX174 噬菌體 （單鏈環(huán)狀， 5386bp ， DNA 復(fù)制時(shí)可以雙鏈形式存在） DNA 中發(fā)現(xiàn) HgaⅠ 切割某些位點(diǎn)比其它的快。在腺病毒 2 中， CTCGAG 位點(diǎn)對(duì) PaeR7Ⅰ *抵抗，但同裂酶 XhoⅠ 卻很易切割，原因是 5' 末端有一個(gè) CT 二核苷酸，與甲基化*無(wú)關(guān)。

造成上述現(xiàn)象的原因有以下幾種情況。 NarⅠ ， NaeⅠ 和 SacⅡ 三種酶屬于在切割 DNA 之前需要同時(shí)與兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)作用的一類酶。 BspMⅠ、EcoRⅡ 和 HpaⅡ 則屬另一種情況，它們對(duì)要求作用的 DNA 序列上有兩個(gè)明顯不同的結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)是為 DNA 切割激活另一個(gè)的變構(gòu)位點(diǎn)（allosteric）。這兩序列可由順式（cis）方式提供，即相互靠近或形成環(huán)（loop）;或由反式（trans）方式提供，其變構(gòu)位點(diǎn)由含識(shí)別序列的寡核苷酸提供。

六、酶切反應(yīng)條件

1.緩沖液

常規(guī)緩沖液一般包括提供穩(wěn)定 pH 值的緩沖劑、 Mg++ 、 DTT（二硫蘇糖醇）以及 BSA（小牛血請(qǐng)白蛋白）。

pH 經(jīng)常為 7.0-7.9（在 25℃ 時(shí)），用 Tris-HCl 或乙酸調(diào)節(jié); Mg++ 作為酶的活性中心，由 MgCl2 和 MgAc 提供; 濃度常為 10mM ;DTT 濃度常為 1mM 。有時(shí)緩沖液中還要加入 100mg/ml BSA ，但只是少數(shù)反應(yīng)需要。不同的酶對(duì)離子強(qiáng)度的要求差異很大，并依次將限制酶緩沖液按離子強(qiáng)度的差異分為高、中、低三種類型，離子強(qiáng)度以 NaCl 來(lái)滿足，濃度分別為 100mM 、50mM 和 0mM 。

要對(duì) DNA 進(jìn)行雙酶切時(shí)，如何選擇緩沖液是相當(dāng)重要的。一方面可選用都合適的緩沖液或通用緩沖液;若找不到共用的緩沖液則先用低濃度的，再加適量 NaCl 和第二種酶;或先用低鹽緩沖液再用高鹽緩沖液（DNA 可純化或不純化）。

2.反應(yīng)溫度

反應(yīng)溫度大多數(shù)為 37℃ ，一部分為 50-65℃ ，少數(shù) 25-30℃ 。高溫作用酶在 37℃ 下的活性會(huì)下降，多數(shù)僅為zui適條件下的 10-50% 。如 Taq 限制酶（正常反應(yīng)溫度為 65℃），在 37℃ 只有在 65℃ 活性的 10% ; ApoⅠ（正常反應(yīng)溫度為 50℃）， 37℃ 只有在 50℃ 時(shí)活性的 50% 。銷售商在產(chǎn)品說(shuō)明中都會(huì)標(biāo)明*反應(yīng)溫度。

3.反應(yīng)時(shí)間

反應(yīng)時(shí)間通常為 1 小時(shí)或更多，許多酶延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可減少酶的用量。 EcoRⅠ 若反應(yīng) 16 小時(shí)，所需酶量為正常酶切時(shí)間的 1/8 ，即若反應(yīng)時(shí)間為 16 小時(shí)，則所用酶量為只切 1 小時(shí)的 1/8 。其它一些酶也有類似情況，如HindⅢ為1/8;KpnⅠ為1/4;BamHⅠ為1/2。

4.終止酶切的方法

EDTA 可鏊合鎂離子，從而可終止酶切反應(yīng)，終止?jié)舛葹?/span> 10mM ;加熱是常用的方法，對(duì)于*反應(yīng)溫度為 37℃ 的酶，在 65℃ 或 80℃ 處理 20 分鐘可使酶活性大部分喪失。但是對(duì)于在 80℃ 作用 20 分鐘也有不失活的酶，如*反應(yīng)溫度為 37℃ 的酶 Bg1Ⅱ、HpaⅠ 和 PvuⅡ ， 65℃ 酶 Tth111Ⅰ 和 TspRⅠ ，以及 50℃ 酶 Bc1Ⅰ ，可用抽提去除蛋白，或用試劑盒純化 DNA 。

七、星星活性（star activity）

在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性。實(shí)際上星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn)，如 ApoⅠ、AseⅠ、BamHⅠ、BssH11、EcoRⅠ、EcoRV、HindⅢ、HinfⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、ScaⅠ、TaqⅠ 和 XmnⅠ 等酶皆可表現(xiàn)出星星活性。星星活性在絕大多數(shù)情況下是可控制的。

限制酶的特異性變化方式與酶的種類和所用的條件有關(guān)，zui普遍的活性變化來(lái)自 1 個(gè)堿基的變化、識(shí)別位點(diǎn)外層堿基的隨意性，以及單鏈缺口。

引起星星活性的因素有油濃度高（>5%），酶過(guò)量（>100U/ml），離子強(qiáng)度低（<25mM）， pH 值過(guò)高（>8.0），或是加了有機(jī)溶劑如 PMSD （二甲基亞砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、 sulphalane 等等，或是用其它二價(jià)陽(yáng)離子如 Mn++ 、Cu++、Co++ 或 Zn++ 代替了 Mg++ 。但不同的酶對(duì)上述條件的敏感性不一樣，如 PstⅠ 比 EcoRⅠ 對(duì)高 pH 更敏感，但后者對(duì)油濃度更敏感。

抑制星星活性的措施有許多，如減少酶的用量（可避免過(guò)份酶切），減少油濃度，保證反應(yīng)體系中無(wú)有機(jī)溶劑或乙醇，提高離子強(qiáng)度到 100～150mM （如果不會(huì)抑制酶的活性的話），降低反應(yīng) pH 至 pH7.0 ，以及保證使用 Mg++ 作為二價(jià)陽(yáng)離子。

八、單鏈 DNA 的切割

部分切割雙鏈 DNA 的酶也可消化其單鏈，但是切割效率不同。 HinPⅡ、HhaⅠ、MnlⅠ 切割單鏈 DNA 的效率是切割雙鏈的 50% ， HaeⅢ 切割單鏈 DNA 的效率是切割雙鏈的 10% ， BstNⅠ、DdeⅠ、HgaⅠ、HinfⅠ、TaqⅠ 切割單鏈 DNA 的速度比切割雙鏈慢 100 倍。還有一些酶不切割單鏈 DNA ，如 AluⅠ、BbvⅠ、DpnⅠ、FnuDⅡ、FokⅠ、HpaⅡ、HphⅠ、MobⅠ、MobⅡ、MspⅠ、Sau3AⅠ、SfaNⅠ 等等。

有些限制酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈，產(chǎn)生單鏈缺口，即切口酶（nicking enzyme），如 N.BstNBⅠ。這類酶在命名時(shí)前面要加一個(gè) N 。目前已經(jīng)商品化的這類酶共有 7 種。 N.BstNBⅠ 的識(shí)別序列和切割位置如下。

5′... G A G T C N N N N N ...3′

3′... C T C A G N N N N N ...5′

九、酶切位點(diǎn)的引入

在酶切水平上，通過(guò)酶切和連接可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。

（1）將產(chǎn)生的 5' 突出端補(bǔ)平后，再連接可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。 EcoRⅠ 的識(shí)別位點(diǎn)是 GAATTC ，先用它來(lái)切片段，將 5' 突出端補(bǔ)平后，再連接可產(chǎn)生 XmaⅠ（GAANNNNTTC）和 AceⅠ（ATTAAT）酶切位點(diǎn)，而 EcoRⅠ 的酶切位點(diǎn)消失。

……G AATTC…… 補(bǔ)平 ….GAATT AATTC…. 連接 ….GAATTAATTC…

……CTTAA G…… ….CTTAA TTAAG…. ….CTTAATTAAG…

對(duì) HindⅢ 位點(diǎn)（AAGCTT）來(lái)說(shuō)，經(jīng)酶切和連接可產(chǎn)生 AluⅠ 和 NheⅠ 酶切位點(diǎn)，同時(shí) HindⅢ 位點(diǎn)消失。

（2）同尾末端的連接。不同的同尾酶切割 DNA 產(chǎn)生的末端再相互連接時(shí)，可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，同時(shí)原來(lái)的酶切位點(diǎn)卻消失。例如 BamHⅠ（G↓AATCC）+ BclⅠ（T↓GATCA）→ AlwⅠ（GGATC 4/5），又如 XbaⅠ（T↓CTAGA）+AvrⅡ，或 NheⅠ 或 SpeⅠ 或 StyⅠ（CCTAGG）→ BfaⅠ（C↓TAG） 也產(chǎn)生了新的酶切位點(diǎn)。

（3）平端連接。平末端的限制酶切割的DNA在連接后也可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，例如 PvuⅡ（CAGCTG）+ EcoRV（GATATC）→ MobⅠ（GATC）。

十、影響酶活性的因素

影響酶切活性的因素有許多，概略的說(shuō)可分為外因和內(nèi)因。外因是可預(yù)見和控制的，如反應(yīng)條件、底物的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽酚的污染）、何時(shí)加酶、操作是否恰當(dāng)、反應(yīng)體積的選擇以及反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短等等。內(nèi)因包括位點(diǎn)偏愛性、甲基化底物、底物的構(gòu)象。構(gòu)象的影響主要指切割線性 DNA 和超螺旋 DNA 時(shí)的活性，如與切割 lDNA 相比， EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ 需要至少 2.5-10 倍的酶來(lái)切割 pBR322 的超螺旋 DNA 。 PaeRTⅠ 與 XhoⅠ 切割相同的序列（C↓TCGAG），但如果 5' 端為 CT 則 PaeRTⅠ 不能切割。

十一、酶切位點(diǎn)在基因組中分布的不均一性

在基因組中堿基對(duì)的排列是非均勻的，因此盡管有的酶切序列中 GC 含量相同，但在基因組中出現(xiàn)的機(jī)率還是不一樣。如在 E.coli 中， AsoⅠ（GGCGCGCC）切點(diǎn)平均 20kb 中出現(xiàn)一個(gè)，而 NotⅠ（GCGGCCGC） 切點(diǎn)平均 200kb 中出現(xiàn)一個(gè)（常利用它出現(xiàn)的機(jī)會(huì)少來(lái)構(gòu)建圖譜）， EcoRⅠ 和 HindⅢ 切點(diǎn)平均 5kb 中出現(xiàn)一個(gè)，而 SpeⅠ（ACTAGT） 切點(diǎn)平均 60kb 中出現(xiàn)一個(gè)。