“XXXX”動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法
技術(shù)文檔編號(hào)：TBD0017SOP
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
| | 名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 |
| A | XXXX 動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞分離液 | | 200ml |
| B | 樣本稀釋液（贈(zèng)品） | 2010C1119 | 200ml |
| C | 清洗液（贈(zèng)品） | 2010X1118 | 200ml |
| D | 說(shuō)明書(shū) | | 1 份 |
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
1. 適用儀器
最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
2. 抗凝劑的選擇
在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采血時(shí)，很多實(shí)驗(yàn)者選擇醫(yī)用真空獲得抗凝血，醫(yī)用中的抗凝 劑只考慮血漿質(zhì)量，但不利于高純度細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)。
為此，別開(kāi)發(fā)出抗凝劑及抗凝管專用于細(xì)胞分離，改變使用普通 獲得抗凝血分離效果不佳，提取率及純度低下的不良結(jié)果。
3. PBMC 高效離心管（詳見(jiàn) PBMC 高效離心管使用說(shuō)明）
| 序號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 規(guī)格 |
| 1 | PBMC 高效離心管 | 601001 | 50ml |
| 2 | PBMC 高效離心管（隨試劑盒附贈(zèng) 5 支） | 601002 | 15ml |
【檢驗(yàn)方法】
全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119）混勻，根據(jù)稀釋后的樣本量大小，分以下兩種情況：
情況 A：稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1. 取一支 15ml 離心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液（注：分離液最少不得少于 3ml）。
2. 用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注： 根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離 心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果）。
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8. 250g，離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
情況 B：稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1. 取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，先加入與稀釋后樣本等量的分離液。
2. 將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，550-650g（最大離心力可至 1000g）， 離心 20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果。加入血液樣本后，樣 本及分離液總體積不得超過(guò)離心管總體積的三分之二）。
3. 剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟 9。分離圖例
【注意事項(xiàng)】
1. 全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2. 本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
3. 吸取過(guò)多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒 細(xì)胞數(shù)量增加。
4. 吸取過(guò)多的淋巴細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度均大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
| | 紅細(xì)胞 | 白細(xì)胞 | 血小板 |
| 含量（個(gè)/L） | （4.0-5.5）×1012 | （4.0-10.0）×109 | （1.0-3.0）×1011 |
| | | 中性粒細(xì)胞 | 淋巴細(xì)胞 | 單核細(xì)胞 | |
| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
1. 所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2. 所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
3. 所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法
A. 流式細(xì)胞技術(shù)
B. 免疫組化技術(shù)
C. 原位雜交技術(shù)
D. PCR 技術(shù)
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：
| 出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
| 離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
| 離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng) |
| 離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過(guò)大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
| 離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn) | 細(xì)胞密度過(guò)小 |
2. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離 心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3. 本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可 能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到分離效果， 離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。
