甘油含量測試盒說明書
一、產(chǎn)品描述： 甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。甘油三酯水解生成 1 分子甘油和 3 分子游離脂肪酸，稱為脂肪分解。脂 蛋白酯酶水解血中甘油三酯；胰脂酶水解食物中的甘油三酯；激素敏感脂肪分解酶水解脂肪細(xì)胞中的甘油三 酯。與游離脂肪酸一樣，甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測指標(biāo)，但檢測更加方便。本試劑盒釆用甘 油磷酸氧化酶法與經(jīng)典 GPO Trinder 酶學(xué)反應(yīng)，通過比色測定液體樣品甘油含量。試劑盒經(jīng)過優(yōu)化使得操作 簡単，檢測靈敏度 10umol/L,線性范圍 10-1200 umol/L,可靠性和重復(fù)性俱佳。適合生物醫(yī)學(xué)、食品實驗 室檢測。
二、測定原理： 在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過氧化氫，在過氧 化氫酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醍亞胺，光密度值與甘油濃度成正比。
三、 產(chǎn)品用途：測定血液、細(xì)胞培養(yǎng)基、體液、酒類飲料中的甘油。
四、試劑組成及配制：(100-500T) 試劑組成 規(guī)格 保存條件 R1 40 mlXl 瓶 本試劑盒 4°C 避光 保存，有效 期 3 個月 R2 10 mix 1 瓶 4mM 甘油標(biāo)準(zhǔn)品 1ml X 1 支 工作溶液的配制：按 R1：R2= 4:1 比例，即 4ml 試劑 R1 與 1ml 試劑 R2 混合，現(xiàn)用現(xiàn)配,用多少配多少 可供 300?500 次微板測定或 100 次 1 ml 比色杯測定。
五、所需設(shè)備： 酶標(biāo)儀、(721、722 型)可見光分光光度計、生化分析儀。 工作波長 550nm,如無此波長建議優(yōu)先選用 570、530、490nmo比色杯光徑 1cm。
六、操作過程：
1、 樣本處理 1 、酒精、飲品、清澈體液樣本：直接測定，如超過線性范圍用蒸餾水或生理鹽水稀釋后測定。 2 、培養(yǎng)液樣本:取不含酚紅無顏色無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基液，如有細(xì)胞碎片應(yīng) 4°C 條件下 12, 000g 離心 5min 清除，取上清測定。 3 、血液樣本：新鮮抗凝血 4°C 2000g 5min 得到血漿，或非抗凝血 4°C 2 小時取血清。2000g 離心 l0min 除去血細(xì)胞。70°C l0min 滅活內(nèi)源脂肪酶，再次 12, 000g l0niin, 取上清測定或-20 °C 保存。
2、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用蒸餡水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體，將 4mM 甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為 1000、500、250、 125、62.5、31.25、15.625、7.8125 umol/L,通常 4—6 管即可，注意設(shè)置 0 濃度對照反應(yīng)管。
3、甘油測定1 、參見下表加樣。先加標(biāo)準(zhǔn)甘油或待測樣品，后加工作溶液。甘油濃度很低時，可嘗試樣品 與工作液體積 100:100 ul 能否進(jìn)一步增加靈敏度，但樣品超過 100 ul 將稀釋酶濃度而降低靈敏度。 超出線性范圍可適當(dāng)稀釋，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算濃度。 2 、37°C 20min (15?30min)?；?25°C 室溫 30min 但靈敏度略降。反應(yīng)平衡后顏色在 60min 內(nèi)穩(wěn)定 3 、先用蒸餾水空白管調(diào)零，然后測定各管 0D 值。
4 、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算甘油濃度。Excel 作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管 0D 值為 y 軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 x 軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點擊做圖向?qū)?，選擇-散點圖-，點擊-完成-o (2)鼠標(biāo)右鍵 點圖上的 某一點，點擊-添加趨勢線-，點擊-選項-，點擊顯示公式-和-R2 值-。 表 1 酶標(biāo)微板測定的加樣比例(檢測范圍 10-1200 umol/L) (可微量調(diào)整樣品與工作液體積比例) 培養(yǎng)基或低甘油濃度樣品測定 高甘油濃度樣品測定 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 測定管 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 測定管 蒸餛水/生理鹽水 50ul 5ul 標(biāo)準(zhǔn)品 50ul 5ul 樣品 50ul 5ul 工作溶液 150ul 150ul 150ul 195ul 195ul 195ul 表 2 1ml 比色杯測定的加樣比例(檢測范圍 10-1200 umol/L) 培養(yǎng)基或低甘油濃度樣品測定 高甘油濃度樣品測定 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 測定管 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 測定管 蒸餡水/生理鹽水 200ul 50ul 標(biāo)準(zhǔn)品 200ul 50ul 樣品 200ul 50ul 工作溶液 600ul 600ul 600ul 750ul 750ul 750ul
七、 注意事項： 1、細(xì)胞培養(yǎng)須用不含酚紅的無色無血清培養(yǎng)基。正常血清甘油濃度為 20?130umol/L。任何含血清 培養(yǎng)基需 *洗去。2、 試劑混濁或 550nm 處空白反應(yīng)管吸光度大于 0. 2 時棄去。 3、 維生素 C＞0. 18g/L、血紅蛋白＞2g/L、＞0.25g/L、還原劑二硫蘇糖醇、疏基乙醇等干擾測試。
八、 參考文獻(xiàn)： 1、 Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6:24 - 27. 2、 Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97:142 - 145.
