PCR技術(shù)已經(jīng)在生物學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，PCR技術(shù)也日臻完善。PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，敏感度*，正因?yàn)槊舾卸雀?，很容易受其他因素的影響，因此要得到?zhǔn)確可靠的反應(yīng)結(jié)果，需根據(jù)不同的模板，摸索的條件，配制出PCR反應(yīng)試劑。
聚合酶鏈反應(yīng)必須具備下述基本條件：①模板核酸（DNA或RNA），②人工合成的寡核苷酸引物，③合適的緩沖體系，④鎂離子，⑤三磷酸脫氧核苷酸，⑥耐熱dna聚合酶，RNA反轉(zhuǎn)錄酶及RNA酶抑制劑（RNasin）,⑦溫度循環(huán)參數(shù)（變性、復(fù)性和延伸的溫度與時(shí)間及循環(huán)次數(shù)）。

1．模板的選擇

PCR反應(yīng)用DNA（單、雙鏈DNA）或RNA都可以作模板進(jìn)行核酸的體外擴(kuò)增。若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后才能進(jìn)行正常pcr擴(kuò)增。核酸標(biāo)本來源廣泛，可以從純培養(yǎng)的細(xì)胞或微生物中直接提取，也可以從臨床標(biāo)本（血、尿、便、痰、體腔積液、漱口水等）、犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本（血斑、精斑、毛發(fā)等）、病理標(biāo)本（新鮮或固定石蠟包埋標(biāo)本）以及木乃伊標(biāo)本中提取。無論標(biāo)本來源如何，待擴(kuò)增核酸都需部分純化，以使核酸樣品中不混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)。雖然PCR可以僅用微量樣品（甚至是來自單一細(xì)胞的DNA），但為保證反應(yīng)的特異性，一般還宜用納克級(jí)（ng）的克隆DNA、微克水平的染色體DNA或102-105拷貝的待擴(kuò)增DNA片段做起始材料。

2．引物

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及擴(kuò)增的靶序列在基因組中的位置是由引物限定的。因此，引物的選擇與合成對(duì)PCR成功與否具有決定性意義。對(duì)某一dna片段來說，由于同源順序的存在，隨意設(shè)計(jì)的兩條引物鏈，其PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)多條電泳帶。因此，在引物的設(shè)計(jì)過程中要考慮引物鏈的特異性，即它們只與被檢測(cè)的DNA片斷互補(bǔ)。

(1) 引物長(zhǎng)度以16-30個(gè)堿基為宜，zui20-24個(gè)bp，不會(huì)形成穩(wěn)定的復(fù)合體。

(2) 有時(shí)引物不起作用，理由不明，可以移動(dòng)序列位置來解決。

(3) （G+C）%含量一般40%-60%為佳，兩個(gè)引物中（G+C）%含量應(yīng)盡量相似。

(4) 兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在引物3’端避免形成“引物二聚體”。如無法避免，其3’端互補(bǔ)不應(yīng)大于2個(gè)堿基。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，避免同源序列（尤其6個(gè)以上相同）。

(5) 引物內(nèi)部避免形成次級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)卡結(jié)構(gòu)，必要時(shí)應(yīng)通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

(6) 引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個(gè)弊端，一是易形成引物二聚體，二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶目標(biāo)并且起始材料又不太純時(shí)容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般來說，用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，反應(yīng)特異性也較好。

3．鎂離子濃度

Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和產(chǎn)量有著顯著影響。PCR中常用的體系應(yīng)Mg2+濃度為1.5mmol/L，但對(duì)不同的反應(yīng)體系應(yīng)優(yōu)化Mg2+濃度。濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物產(chǎn)量減少。PCR反應(yīng)中Mg2+的加入量要比dNTP濃度高0.5-2.5mmol/L。對(duì)每種PCR反應(yīng)體系Mg2+量的優(yōu)化。另外，還需注意引物和模板DNA原液中是否含EDTA等螯合劑影響游離Mg2+的濃度。