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培養(yǎng)基
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PCR反應(yīng)程序

時間:2017/8/14閱讀:716
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1.常規(guī)程序 
將 PCR 反應(yīng)所需的成分配置完后,在 PCR 儀上于 94-96℃ 預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘,使模板 DNA 充分變性,然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個循環(huán)中,先于 94℃ 保持 30 秒鐘使模板變性,然后將溫度降到復(fù)性溫度(一般 50-60℃ 之間),一般保持 30 秒鐘,使引物與模板充分退火;在 72℃ 保持 1 分鐘(擴(kuò)增 1kb 片段),使引物在模板上延伸,合成 DNA ,完成一個循環(huán)。重復(fù)這樣的循環(huán) 25~35 次,使擴(kuò)增的 DNA 片段大量累積。zui后,在 72℃ 保持 3-7min ,使產(chǎn)物延伸完整, 4℃ 保存。 

2.復(fù)性(退火)和延伸溫度 
復(fù)性的溫度是 PCR 擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素,通常在 50-60℃ 之間。具體的溫度主要由引物的 Tm 值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為 72℃ 。如果復(fù)性的溫度很高,可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度,變成二步法 PCR 。 

3.反應(yīng)時間 
變性步驟一般使用 30 秒鐘,如果模板的 G+C 含量較高,或直接用細(xì)胞做模板,變性時間可適當(dāng)延長。復(fù)性時間有 30 秒種一般是足夠的。延伸時間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定,一般采用 1kb 用 1 分鐘來保證充足的時間。 

4.循環(huán)次數(shù) 
循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān),在模板拷貝數(shù)為 104~105 數(shù)量級時,循環(huán)數(shù)通常為 25~35 次。 
平臺效應(yīng)(plateau effect):PCR 擴(kuò)增過程后期會出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。原因:底物和引物的濃度已經(jīng)降低,dNTP 和 DNA 聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低 ,產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用,非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用,擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性,高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不*。 

5.PCR 反應(yīng)液的配制 
pcr反應(yīng)體系的配置方式有時也會影響反應(yīng)的正常進(jìn)行。常規(guī)方法與其它酶學(xué)反應(yīng)一樣,在zui后加入 DNA 聚合酶。早期的 PCR 儀沒有帶加熱的蓋子,要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油,防止水分蒸發(fā)。 
對于使用具 3’-5’ 外切活性的高溫 DNA 聚合酶時,有時會擴(kuò)增不出產(chǎn)物。在遇到這個問題時,如果將反應(yīng)成分分開配制,A 管含模板、引物和 dNTP ,以及調(diào)整體積的 H2O , B 管含緩沖液、DNA 聚合酶和水,然后再將兩管溶液混合起來,可較好地克服這個問題。 
按照常規(guī)的方法配制反應(yīng)體系,有時會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的問題。熱啟動(hot start)PCR操作方式可較好解決這一問題。將 dNTP 、緩沖液, Mg2+和 primer 先配制好,然后加入一粒蠟珠(如 Ampli Wax PCR Qam100),加熱熔化,再冷卻,使蠟將溶液封住,zui后加入模板和 DNA 聚合酶等剩余成分。只有

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