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血清
細胞分離試劑
試劑盒

哺乳動物細胞總RNA的分離

時間:2017/7/18閱讀:822
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一、細胞的裂解 
單層細胞的裂解 
懸浮培養(yǎng)的細胞或組織單細胞懸液的裂解 
a.單層細胞的裂解 
a)吸出培養(yǎng)液,以7ml用冰預(yù)冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細胞培養(yǎng)皿內(nèi)的單層細胞,重復(fù)1次,將平板置于冰上直至所有單層細胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上,再將鋁板置于冰盤上。 
b)直徑為90mm的培養(yǎng)皿需加0.5ml RNA提取緩沖液, 并使之遍布整個平板的表面。 
RNA提取緩沖注液 
0.14mol/L NaCL 
1.5mmol/L MgCL2 
10mmol/L Tris.CL(pH8.6) 
0.5NP-40 

1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT 
100單位/ml胎盤rna酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復(fù)合物 
c)加0.5ml蛋白酶消化緩沖液,用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。 
蛋白酶消化緩沖液 
0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0) 
25mmol/L EDTA(pH8.0) 
0.3mol/L NaCl 
2 SDS 

d)用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物,再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復(fù)34次,剪切DNA。 
c)加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml,充分混勻后置于37溫育30分鐘。 
蛋白酶K以貯存液的形式保存,貯存液為20mg/ml 蛋白K溶液。 
b.懸浮培養(yǎng)的細胞或組織單細胞懸液的裂解 
a)于42000g離心5分鐘收集細胞,以10倍體積用冰預(yù)冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀,洗滌細胞3次,每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細胞沉淀,使其*分散。 
b)估計細胞沉淀的體積,用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。 
c)加入與步驟b)所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液,用振蕩器迅速混勻。用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物,再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復(fù)34次,剪切DNA 
d)加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml,充分混勻后置于37溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存,貯存液為20μg/ml蛋白酶K水溶液。 
二、提取步驟 
1)用等體積酚:仿抽提1次,以去除蛋白質(zhì)。 

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