原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行pcr反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù).
原位PCR是Hasse等于1990年建立的，實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等.其基本方法為①固定組織或細(xì)胞:將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物酶.②蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片55℃消化處理2h后，96℃2min以滅活蛋白酶K.③PCR擴(kuò)增:在組織細(xì)胞片上，加PCR反應(yīng)液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增.有的基因擴(kuò)增儀帶有專(zhuān)門(mén)用于原位PCR的裝置.④雜交:PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交.⑤顯微鏡觀察結(jié)果.
原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過(guò)程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實(shí)用價(jià)值.其特異性和敏感性高于一般的PCR.
連接酶鏈反應(yīng)
連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，主要用于點(diǎn)突變的研究及靶基因的擴(kuò)增.
連接酶鏈反應(yīng)是Backman1997年為檢出靶基因序列中的點(diǎn)突變而設(shè)計(jì)發(fā)明，并申報(bào)了.1988年Landegren也進(jìn)行了該項(xiàng)研究.1988年Backman等又因分離熱穩(wěn)定的連接酶，而申報(bào)，1991年Backman和Barany分別用耐熱DNA連接酶進(jìn)行了LCR試驗(yàn).耐熱DNA連接酶可以在熱循環(huán)中保持活性，提高連接反應(yīng)的特異性，排除了背景擴(kuò)增和免除了不斷補(bǔ)充酶的繁瑣程序.
LCR的基本原理為利用DNA連接酶.特異地將雙鏈DNA段連接，經(jīng)變性-退火-連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶基因序列大量擴(kuò)增.其程序?yàn)?/span>:在模DNA、DNA連接酶、寡核苷酸引物以及相應(yīng)的反應(yīng)條件下，首先加熱至一定溫度下(94～95℃)使DNA變性，雙鏈打開(kāi)，然后降溫退火(65℃)，引物與之互補(bǔ)的模板DNA結(jié)合并留下一缺口，如果與靶序列雜交的相鄰的寡核苷酸引物與靶序列*互補(bǔ)，DNA連接酶即可連接封閉這一缺口，則LCR反應(yīng)的三步驟(變性-退火-連接)就能反復(fù)進(jìn)行，每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中作模板，使更多的寡核苷酸被連接與擴(kuò)增.若連接處的靶序列有點(diǎn)突變，引物不能與靶序列結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，也就不能形成連接產(chǎn)物.
LCR的引物是兩對(duì)分別互補(bǔ)的引物，引物長(zhǎng)度為20～26個(gè)，以保證引物與靶序列的特異性結(jié)合，LCR識(shí)別點(diǎn)突變的特異性高于PCR，其特異性首先取決于引物與模板的特異性結(jié)合，其次是耐熱連接酶的特異性.LCR連接反應(yīng)溫度接近寡苷酸的解鏈溫度(Tm)，因而識(shí)別單核苷酸錯(cuò)配的特異性*.
LCR的擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)，用耐熱連接酶做LCR只用兩個(gè)溫度循環(huán)，94℃min變性和65℃復(fù)性并連接，循環(huán)30次左右.其產(chǎn)物的檢測(cè)也較方便靈敏.目前該方法主要用點(diǎn)突變的研究與檢測(cè)、微生物病原體的檢測(cè)及定向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多態(tài)性及單堿基遺傳病的產(chǎn)物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點(diǎn)突變研究等.
依賴核酸序列的擴(kuò)增
依賴核酸序列的擴(kuò)增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，又稱(chēng)自主序列復(fù)制系統(tǒng)(self-sustainedsequence replication，3SR)或再生長(zhǎng)序列復(fù)制技術(shù).1990年Guali等首先報(bào)道了這一技術(shù).NASBA主要用于RNA的擴(kuò)增、檢測(cè)及測(cè)序.該反應(yīng)有賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同協(xié)作而完成.
NASBA反應(yīng)體系中除含有上述三種酶外，還含有dNTP，NTP(核糖核苷)，
兩種特殊的引物和緩沖液.引物I3"末端與靶序列互補(bǔ)，5"端含T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子，這一引物是用于合成cDNA的.引物Ⅱ的堿基序列與cDNA的5"未端互補(bǔ).
在NASBA反應(yīng)時(shí)，首先引物Ⅰ與RNA模板復(fù)性(結(jié)合)，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，RNaseH水解cDNA上的RNA，形成一條單鏈的DNA;引物Ⅱ隨即與此cDNA的5"未端結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶在此DNA模板的指導(dǎo)下合成第二條DNA鏈.這樣形成的DNA雙鏈含有T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子.該酶即以此DNA為模板，轉(zhuǎn)錄出與樣品RNA序列相同的RNA鏈，而且每條DNA模板在該酶的作用下可合成約100個(gè)拷貝的RNA.每條新的RNA又可作為逆錄酶的模板合成cDNA.如此反復(fù)進(jìn)行，將獲得更多的RNA和cDNA.
其基本方法為:將引物，標(biāo)本加入擴(kuò)增反應(yīng)液，65℃1min使RNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，降溫至37℃加入逆轉(zhuǎn)錄酶，T7RNA聚合酶和RNaseH，并在37℃反應(yīng)1～1.5小時(shí)，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，溴乙錠染色即可在紫外儀下看到條帶.NASBA的特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán).整個(gè)反應(yīng)過(guò)程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高，其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好.
轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)
轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)(Transcript-based amplification system，TAS)，是Kwen等人于1989年研究報(bào)道的，主要用于擴(kuò)增RNA.
合成A、B引物，引物A的3"末端與待擴(kuò)增RNA互補(bǔ)，其5"端有T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子信息.逆轉(zhuǎn)錄酶以A引物為起點(diǎn)合成cDNA;引物B與此cDNA3"端互補(bǔ)合成cDNA第二鏈.逆轉(zhuǎn)錄酶除具有逆轉(zhuǎn)錄活性外，還有DNA多聚酶的活性及RNaseH的活性.T7RNA多聚酶又以此雙鏈DNA為模板.轉(zhuǎn)錄出與待擴(kuò)增RNA一樣的RNA，這些RNA又可作為下輪反應(yīng)的模板.T7RNA多聚酶的催化效率很高，一個(gè)模板可轉(zhuǎn)錄10～103個(gè)RNA拷貝，因而反應(yīng)液中待檢RNA的數(shù)量以10的指數(shù)方式擴(kuò)增.
TAS的主要特點(diǎn)是擴(kuò)增效率高，因?yàn)槠?/span>RNA拷貝數(shù)呈10的指數(shù)方式增加，只需6個(gè)循環(huán)靶序列的拷貝數(shù)就能達(dá)到2×106.它的另一個(gè)特點(diǎn)是特異性高，由于TAS只能進(jìn)行6次溫度循環(huán)，錯(cuò)摻率低，加之用葡聚糖珠夾心雜交，因而特異性也高.雖然本法有較高的特異性和敏感性，但其循環(huán)過(guò)程復(fù)雜，需重復(fù)加入逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶，有待進(jìn)一步研究.
Qβ復(fù)制酶反應(yīng)
Kacian等于1972年報(bào)報(bào)Qβ復(fù)制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板的自我復(fù)制功能，它能在常溫30min，將其天然模模MDV-1RNA擴(kuò)增至109.1986年Chu等報(bào)道用生物標(biāo)記的靶序列特異性探針，可與親和素聯(lián)接的MDV-1RNA雜交，經(jīng)洗脫未被結(jié)合的MDV-1后，再加入Qβ復(fù)制酶，擴(kuò)增復(fù)制MDV-1拷貝，然后用溴乙錠染色檢測(cè)或用同源性的第二探針雜交.
Qβ復(fù)制酶是一種RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，它有3個(gè)特點(diǎn):①不需寡核苷酸引物的引導(dǎo)就可啟動(dòng)RNA的合成.②能特異地識(shí)別RNA基因中由于分子內(nèi)堿基配對(duì)而形成的*的RNA折疊結(jié)構(gòu).③在Qβ復(fù)制酶的天然模板MDV-1RNA的非折疊結(jié)構(gòu)區(qū)插入一短的核酸序列不影響該酶的復(fù)制.因而，如在此區(qū)插入核酸探針，則其序列照樣可能被Qβ復(fù)制酶擴(kuò)增.
