一、從原代組織中分離細(xì)胞 將組織塊分離(散)成細(xì)胞懸液的方法有多種，zui常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法。

從原代組織中獲得單細(xì)胞懸液的一般方法是酶解聚。細(xì)胞暴露在酶中的時(shí)間要盡可能的短，以保持zui大的活性。下列步驟可以解聚整個(gè)組織，獲得較高產(chǎn)量的有活性細(xì)胞。

1. (Trypsin)

●在去除不需要的組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。

●將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的中的(100mg組織加入1ml )。

●在4℃孵育6到18小時(shí)，使幾乎沒有活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。

●移棄組織碎片中的，在37℃孵育包含殘留的組織碎片20到30分鐘。

●在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基，要加入大豆抑制劑。

●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)(100～200mm)過濾，分散所有剩余組織。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

2.膠原酶 (Collagenase)

●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用Hanks"平衡液(HBSS)清洗組織碎片幾次。

●加入膠原酶(50～200單位/ml，溶解在HBSS中)。

●在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。

●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。

●通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

3.Dispase

●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用不含鈣鎂的清洗組織碎片幾次。

●加入Dispase(0.6～2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的)

●在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。

●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。

●通過離心在中清洗懸液幾次。

●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

二、從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞:以下是從基層迅速分離細(xì)胞，且保持細(xì)胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對(duì)于所有細(xì)胞系的廣泛應(yīng)用，每一種系統(tǒng)條件和施用濃度應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)加以確定。

●再次培養(yǎng)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的活性。

●細(xì)胞的活率應(yīng)該超過90%

●對(duì)于無血清培養(yǎng)基，降低使用量。

1. 移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基。

2. 使用不包含有鈣鎂的或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細(xì)胞(看表確定正確的清洗溶液)。在培養(yǎng)瓶對(duì)著細(xì)胞的一面加入清洗溶液，通過轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層，然后去除清洗液。

3. 以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養(yǎng)瓶對(duì)著細(xì)胞的一面。確保分離液覆蓋細(xì)胞層。在37℃孵育培養(yǎng)瓶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。通常，在5到15分鐘內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)脫落。細(xì)胞分離需要的時(shí)間因細(xì)胞系不同而有所變化。仔細(xì)監(jiān)測(cè)細(xì)胞分離過程，避免細(xì)胞受損傷。對(duì)難于從培養(yǎng)瓶基層分離的細(xì)胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過程。

4. 當(dāng)細(xì)胞*分離時(shí)，垂直放置培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基，通過移液管在單層細(xì)胞表面反復(fù)吹打來分散細(xì)胞。計(jì)數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞。

5. 對(duì)于無血清培養(yǎng)基，加入大豆抑制劑。通常使用1∶1(v∶v)0.25mg/ml抑制劑到中將抑制活性。