1 RNA 干涉現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其特點(diǎn)

十多年前,科學(xué)家在努力進(jìn)行生物遺傳改良時(shí),發(fā)現(xiàn)靶生物體內(nèi)產(chǎn)生了一種非期望的表型。早期事例來(lái)自于兩個(gè)獨(dú)立的研究團(tuán)體,一個(gè)由美國(guó)的Jorgensen 所,另一個(gè)為荷蘭的Mol 所帶領(lǐng)。他們?cè)噲D通過(guò)增加色素合成基因的拷貝數(shù)來(lái)創(chuàng)造一種紫色更深的矮牽牛,但其結(jié)果出人意料, 一些轉(zhuǎn)基因植株部分*開(kāi)出白花,這表明色素合成途徑被關(guān)閉而不是被加強(qiáng)。事實(shí)上,不僅僅該轉(zhuǎn)入的基因不表達(dá),而且植株中所有的色素合成基因都失活。他們將這一現(xiàn)象稱之為共抑制。幾年以后,英國(guó)的植物研究者Ruiz 等在進(jìn)行抗病毒的植物遺傳工程研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。他們將X病毒繁殖所必需的編碼復(fù)制酶的基因轉(zhuǎn)入到西紅柿中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些植株表現(xiàn)為抗病毒, 而另一些則不抗病毒。進(jìn)一步研究表明,抗病毒的植株產(chǎn)生非常少的復(fù)制酶,而感病的植株則大量表達(dá)X病毒復(fù)制酶,抗病植株能使轉(zhuǎn)入的X 病毒的復(fù)制酶基因沉默。意大利的Cogoni 將類胡蘿卜素合成所需基因轉(zhuǎn)入到粗糙脈孢菌(Neu- rospopracrassa) 中,結(jié)果導(dǎo)致30 %的粗糙脈孢菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞中自身基因失活。他們叫這種基因失活現(xiàn)象為壓制。

雙鏈RNA 能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默zui初來(lái)自于對(duì)線蟲(chóng)的研究。1995 年Guo 和Kewphues 試圖用反義rna 來(lái)阻斷Par - 1 基因的表達(dá)以研究其功能,反義RNA 抑制了基因表達(dá),出乎意料的是用作陰性對(duì)照的正義RNA 也抑制了基因表達(dá),該結(jié)果一直讓人迷惑不解。三年后Fire 和Mello 通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究后提出了雙鏈RNA 能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的理論。Fire 和Mello 發(fā)現(xiàn)把反義RNA 和正義RNA 的混合物導(dǎo)入線蟲(chóng)后,混合物抑制效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于單獨(dú)導(dǎo)入反義RNA 或正義RNA 的抑制效應(yīng)。后來(lái)Baulcomb 和Hamilton 發(fā)現(xiàn)25nt 的 RNA 能特異性抑制具有相應(yīng)互補(bǔ)序列的基因表達(dá)。
2 RNAi 機(jī)制

首先外源導(dǎo)入的雙鏈核糖核酸(dsRNA) 被切割為21～ 23nt 的小分子干擾核糖核酸( siRNA) 。切割后的siRNA 具有3’兩個(gè)核苷酸TT 突出末端。然后siRNA 結(jié)合到核糖核酸酶復(fù)合物上形成 RNA 誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體(RISC ,RNA - induced silencing complex) 。該復(fù)合體依賴ATP 釋能而將 siRNA 雙鏈解聚成單鏈以激活RISC。活化的 RISC 通過(guò)切割與siRNA 具有同源互補(bǔ)序列的基因轉(zhuǎn)錄體,zui終導(dǎo)致基因沉默效應(yīng)。目前具體的切割機(jī)制還不明了,研究表明每個(gè)RISC 包括單鏈 siRNA 和核糖核酸酶RNase 。如圖1 所示。
RNAi技術(shù)概述