實驗?zāi)康?nbsp;
1. 學(xué)習(xí)pcr反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)。 
2. 了解引物設(shè)計的一般要求。 

實驗原理 
單鏈DNA在互補寡聚核苷酸片段的引導(dǎo)下，可以利用DNA聚合酶按5’→3’方向復(fù)制出互補DNA。這時單鏈DNA稱為模板DNA，寡聚核苷酸片段稱為引物（primer），合成的互補DNA稱為產(chǎn)物DNA。雙鏈DNA分子經(jīng)高溫變性后成為兩條單鏈DNA，它們都可作為單鏈模板DNA，在相應(yīng)的引物引導(dǎo)下，用DNA聚合酶復(fù)制出產(chǎn)物DNA。PCR反應(yīng)應(yīng)用以上的基本過程，分別在待復(fù)制的已知序列DNA分子兩端各設(shè)計一條引物，其中在DNA 5’端的引物（Pl）對應(yīng)于上鏈DNA單鏈的序列，3’端的引物（P2）對應(yīng)于下鏈DNA單鏈的序列，Pl和P2按5’→3’方向相向配置。在含有引物、DNA合成底物dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四種脫氧核糖核苷酸等摩爾數(shù)混合物）的緩沖液中，通過高溫變性，使雙鏈DNA變成單鏈DNA模板，降低溫度復(fù)性，使引物與模板DNA配對，利用DNA聚合酶便可合成產(chǎn)物DNA。引物和dNTPs過量，則在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)性和DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物DNA重復(fù)合成，并且在重復(fù)過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的模板DNA參與DNA的合成，使產(chǎn)物DNA的量按2n方式擴增，所以這一反應(yīng)稱為聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)。理論上如果引物及dNTP的量能夠滿足，則這一過程可無限重復(fù)，使模板DNA無限擴增。PCR反應(yīng)使幾個DNA模板分子通過數(shù)小時擴增后增加到百萬倍以上，因此能用微量樣品獲取目的基因，同時也完成了基因在體外的克隆，成為分子生物學(xué)及基因工程中極為有用的研究手段。另外在醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療診斷中亦體現(xiàn)出的應(yīng)用價值。 
常規(guī)PCR反應(yīng)用于已知DNA序列的擴增，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為25～35，變性溫度為94℃，復(fù)性溫度為37℃～55℃，合成延伸溫度為72℃，dna聚合酶為Taq酶（可耐受95℃左右的高溫而不失活），DNA擴增倍數(shù)為106～109。 
引物的設(shè)計在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對模板DNA進行擴增，通常引物設(shè)計要遵守以下幾條原則：①引物長度：15~25個核苷酸；②CG含量為40%~60%；③Tm值高于55℃[Tm=4(C+G)+2(A+T)計算]；④引物與模板非特異性配對位點的堿基配對率小于70%；⑤兩條引物間配對堿基數(shù)小于5個；⑥引物自身配對（特別是在引物的3’端）形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不大于3。由于影響引物的設(shè)計的因素比較多，所以常常利用計算機來輔助設(shè)計。
實驗材料和試劑
（一）試劑
1．4×dNTP： lmmol/L datp
lmmol/L dCTP
lmmol/L dGTP
lmmol/L dTTP
2．taq酶：5U/ml
3．模板DNA：0.1mg/ml
4．引物：Pl： 5"-TTCCATATGCCTACTTCAAGTTCT-3"
P2：5"-ACCTAAGCTTGCTTCAAGTTAGTGT-3"
引物溶液濃度：50nmoI/L
（二）器皿 
0.5ml薄壁Eppendorf管
（三）儀器 
PCR自動擴增儀 離心機 
微量注射器 微量移液器 
電泳儀 水平電泳槽 
透射紫外觀察儀

實驗步驟 
（一）準(zhǔn)備PCR反應(yīng)溶液 
1．取薄壁0.5ml Eppendorf管一只，用微量注射器按以下順序分別加入各試劑。 
10×緩沖液 10 ml 
4×dNTP 10 ml 
引物Pl 1 ml 
引物P2 1 ml 
模板DNA 1 ml 
Taq酶 1 ml 
加無菌雙蒸餾水至 100 ml 
2．用手指輕彈Eppendorf管底部，使溶液混勻。在臺式離心機中離心2秒以集中溶液于管底。 
3．加石蠟油50ml封住溶液表面。

（二） PCR擴增反應(yīng) 
將加好樣品的Eppendorf管插在PCR自動擴增儀樣品板上，95℃10分鐘，使模板充分變性。然后按以下步驟在PCR自動擴增儀中進行反應(yīng)，25～35個循環(huán)。 
93℃ 30秒 
55℃ 45秒 
72℃ 45秒 
反應(yīng)完畢，將樣品取出置于冰浴中待用。 

（三）結(jié)果檢測 
本實驗PCR擴增的產(chǎn)物DNA片段長度為609bp，適合于1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。