舉世矚目的基因組計(jì)劃使大量的新基因不斷被發(fā)現(xiàn)，然而單純的基組DNA序列尚不能解答許多生命問(wèn)題。基因是相對(duì)靜態(tài)的，而基因編碼的產(chǎn)物－蛋白質(zhì)則是動(dòng)態(tài)的，具有時(shí)空性和調(diào)節(jié)性，是生物功能的主要體現(xiàn)者和執(zhí)行者。蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、存在方式以及相互作用等直接與生物功能相關(guān)。

在所有生命活動(dòng)中，蛋白質(zhì)之間的相互作用是*的，它是細(xì)胞進(jìn)行一切代謝活動(dòng)的基礎(chǔ)。細(xì)胞接受外源或是內(nèi)源的信號(hào)，通過(guò)其*的信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)其基因的表達(dá)，以保持其生物學(xué)特性。在這個(gè)過(guò)程中，蛋白質(zhì)占有很重要的地位，它可以調(diào)控，介導(dǎo)細(xì)胞的許多生物學(xué)活性。

雖然有一些蛋白質(zhì)可以以單體的形式發(fā)揮作用，但是大部分的蛋白質(zhì)都是和伴侶分子一起作用或是與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物來(lái)發(fā)揮作用的。因此，為了更好地理解細(xì)胞的生物學(xué)活性，必須很好地理解蛋白質(zhì)單體和復(fù)合物的功能，這就會(huì)涉及到蛋白質(zhì)相互作用的研究。在現(xiàn)代分子生物學(xué)中，蛋白質(zhì)相互作用的研究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系、建立相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖，已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的熱點(diǎn)。

一、生物物理學(xué)方法

1.  融合蛋白pull-down實(shí)驗(yàn)

融合蛋白pull-down技術(shù)基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose），當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)該基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有被吸附的“雜質(zhì)"則隨洗脫液流出。

被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或洗脫條件而回收下來(lái)。為了更有效地利用pull-down技術(shù)，可以將待純化地蛋白以融合蛋白地形式表達(dá)，即將“誘餌"蛋白與一種易于純化地配體蛋白相融合。1988年Smith等利用－S－轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase ，GST）融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白。從此GST融合蛋白在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到了的推廣。

GST融合蛋白在經(jīng)過(guò)固定有GST（glutathione）的色譜柱時(shí)，就可以通過(guò)GST與GSH的相互作用而被吸附。當(dāng)再有細(xì)胞抽提物過(guò)柱，就可以得到能夠與“誘餌"蛋白相互作用的興趣蛋白。一般來(lái)說(shuō)，GST融合蛋白pull-down方法用于兩個(gè)方面：一是鑒定能與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì)；二是鑒定兩個(gè)已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。

該方法比較簡(jiǎn)便，避免了使用同位素等危險(xiǎn)物質(zhì)，在蛋白質(zhì)相互作用研究中有很廣泛的應(yīng)用。類似的融合蛋白很多，如與葡萄球菌蛋白A融合的“誘餌"蛋白可以通過(guò)固定有IgG的色譜柱進(jìn)行純化；與寡聚肽段融合的“誘餌"蛋白可以通過(guò)結(jié)合Ni2+的色譜柱進(jìn)行純化；與二氫還原酶融合的“誘餌"蛋白可以通過(guò)固定有氨甲喋呤的色譜柱進(jìn)行純化等等。

2.  親和印跡

親和印跡是將聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后檢測(cè)哪種蛋白能與標(biāo)記了的“誘餌"蛋白發(fā)生作用。此方法所要考慮的是如何保持膜上蛋白的生物活性，如何得到純化的“誘餌"蛋白等。

3.  免疫共沉淀

如果在非變性的條件下裂解細(xì)胞，蛋白質(zhì)之間的相互作用還可以保持，所以就可利用免疫共沉淀方法找出相互作用的蛋白質(zhì)。這其中的例子包括Harlow等。

利用抗體沉淀腺病毒的EIA蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)了真核細(xì)胞中有與EIA蛋白特異結(jié)合的蛋白質(zhì)；McMahon等利用該方法確定了轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白質(zhì)可以與E2F1和c-Myc轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白質(zhì)。

免疫共沉淀既可以用于檢驗(yàn)已知的兩個(gè)蛋白質(zhì)在體內(nèi)的相互作用，也可以找出未知的蛋白質(zhì)相互作用，不管是兩者的哪個(gè)，其原則都是一樣的，都需要用特異性的抗體與其中的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，之后通過(guò)蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G-瓊脂糖微珠將復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后用SDS-PAGE鑒定。

免疫共沉淀中設(shè)置正確的對(duì)照非常重要，因?yàn)樵摲椒赡艹霈F(xiàn)假陽(yáng)性的概率比較高，設(shè)置的對(duì)照包括：在對(duì)照組中使用對(duì)照抗體，以缺失目的蛋白的細(xì)胞系作為陰性對(duì)照等等。

4.  熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的原理是：處于激活狀態(tài)的供體，可以將其本身的熒光傳遞到與之十分鄰近（通常在10 nm 之內(nèi)）的受體上。因此，如果用遺傳突變的綠色熒光蛋白（GFP）或是合成的熒光染料標(biāo)記蛋白質(zhì)，則可以通過(guò)熒光體之間的能量傳遞來(lái)確定兩蛋白質(zhì)的相互作用。

這種方法較之上述的方法有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

（1）蛋白質(zhì)之間的相互作用是發(fā)生在完整細(xì)胞里，比較完整地反映了蛋白質(zhì)在生理狀態(tài)的活動(dòng)。

（2）利用這種方法，可以觀察到蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位。

二、分子生物學(xué)方法

1.  噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是在深刻理解噬菌體遺傳學(xué)和生理學(xué)特性的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。其原理是將蛋白質(zhì)文庫(kù)整合到一個(gè)簡(jiǎn)單的噬菌體顆粒中，利用目的蛋白質(zhì)與特異配基的親和力，篩選和配基特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。噬菌體展示技術(shù)一般要經(jīng)過(guò)多輪的篩選，這樣就可以得到在文庫(kù)中含量很低的與配基特異作用的蛋白質(zhì)。

2.  酵母雙雜交

1989年Field等發(fā)明了酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用了酵母的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子GAL4含有的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域， DNA 結(jié)合域（DNA binding domain， BD）及轉(zhuǎn)錄激活域（DNA activating domain，AD），將已知基因（誘餌基因）和靶基因或含有靶基因的cDNA分別構(gòu)建在含BD及AD質(zhì)粒載體上，當(dāng)這兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，若BD結(jié)合的誘餌蛋白能夠與AD結(jié)合的靶蛋白或文庫(kù)中某些cDNA編碼的蛋白相互作用、彼此間結(jié)合時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致位于側(cè)翼的BD與AD在空間上接近，呈現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子的*活性，啟動(dòng)下游的報(bào)告基因如His及LacZ等基因的表達(dá)，從而在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

因此，利用酵母雙雜交系統(tǒng)能夠篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，還可以研究已知蛋白間的相互作用。利用酵母雙雜交技術(shù)篩選cDNA文庫(kù)分離與誘餌蛋白相互作用的蛋白或研究蛋白間的相互作用，一般首先考慮的問(wèn)題是誘餌載體的構(gòu)建。編碼誘餌蛋白的基因經(jīng)酶切處理后，按照正確的讀碼框與誘餌載體如pGBTK7相連接，再經(jīng)酶切或測(cè)序做進(jìn)一步的驗(yàn)證分析。

構(gòu)建好誘餌載體還要同時(shí)轉(zhuǎn)化誘餌蛋白酵母菌株如Y187和靶蛋白酵母菌株如AH109，進(jìn)行毒性和自激活性檢測(cè)，證明誘餌蛋白的表達(dá)對(duì)酵母正常生長(zhǎng)沒(méi)有毒性，同時(shí)也不能自身激活酵母報(bào)告基因的表達(dá)，可用于篩選文庫(kù)或研究蛋白間的相互作用。第二個(gè)要考慮的問(wèn)題就是靶蛋白載體或酵母雙雜cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。

一般在編碼靶蛋白的基因或cDNA兩端加上同源重組序列，然后與靶蛋白載體如pGADT72Rec共同轉(zhuǎn)化靶蛋白酵母菌株如AH109，在酵母同源重組酶的作用下，靶蛋白基因或cDNA序列整合到載體上，完成靶蛋白載體或cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。zui后一步就是篩選文庫(kù)或直接研究?jī)蓚€(gè)蛋白間的相互作用。

分別含有誘餌蛋白載體和靶蛋白載體的酵母雜交后，在酵母體內(nèi)融合表達(dá)BD誘餌和AD靶蛋白。誘餌蛋白和靶蛋白的相互作用，導(dǎo)致位于側(cè)翼的BD與AD在空間上接近，呈現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子的*活性，啟動(dòng)下游的報(bào)告基因如His及LacZ等基因的表達(dá)，根據(jù)報(bào)告基因的表達(dá)情況，從而達(dá)到分離蛋白或研究蛋白互作的目的。

三、遺傳學(xué)技術(shù)

合成致死篩選

合成致死效應(yīng)是指兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生突變時(shí)會(huì)產(chǎn)生致死效應(yīng)，而當(dāng)每個(gè)基因單獨(dú)發(fā)生突變時(shí)，則無(wú)致死效應(yīng)。這總遺傳學(xué)方法可以用于分析兩個(gè)育幼相同重要功能的蛋白之間的相互作用。由于合成致死突變株是不能存活的，不能直接得到致死菌株，因此，在實(shí)驗(yàn)室中多使用條件突變菌株。如溫度敏感菌株是可以在某些溫度條件下致死的突變型。合成致死篩選所得到的兩種相互作用蛋白可能是同一復(fù)合物的兩種組分或是一種蛋白對(duì)另一種蛋白所有的調(diào)節(jié)作用。

四、展望

蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了多種研究技術(shù)的開(kāi)發(fā)和完善，越來(lái)越多的技術(shù)趨向于大規(guī)模、高通量方向發(fā)展。同時(shí)，物理學(xué)、化學(xué)、信息學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科研究的發(fā)展也大大促進(jìn)了這些技術(shù)的改進(jìn)。

新近發(fā)展的計(jì)算機(jī)分析方法，以基因序列和基因組信息為基礎(chǔ)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用，并涉及對(duì)參與蛋白質(zhì)相互作用的表面殘基的預(yù)測(cè)。

依賴基因序列來(lái)分析蛋白質(zhì)相互作用的分析方法正在形成。而這些的、簡(jiǎn)易的、大規(guī)模分析蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)發(fā)展又推動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)步?？梢灶A(yù)見(jiàn)在不久的將來(lái)，隨著基因組研究和蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷深入，生命科學(xué)中的種種疑難將被逐一攻破。