Marc 145細(xì)胞培養(yǎng)和維持有關(guān)資料綜述

一、 細(xì)胞及培養(yǎng)

1、Marc145細(xì)胞

上皮樣細(xì)胞，來源于猴腎細(xì)胞，從母細(xì)胞（MA 104細(xì)胞）克隆而得到，可連續(xù)培養(yǎng)。

2、生長(zhǎng)培養(yǎng)基

DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-，和110mg/L丙酮酸鈉，不含）＋5－10％新生牛血清+ 1%雙抗（和）的培養(yǎng)液。

3、凍存液

生長(zhǎng)培養(yǎng)基＋10% DMSO

4、細(xì)胞健康生長(zhǎng)的幾項(xiàng)注意事項(xiàng)

（1）細(xì)胞沒有支原體等外源因子的感染。

（2）培養(yǎng)液的pH值可在7.0－7.3，以7.2為佳。

（3）一般按1：3傳代，細(xì)胞接種密度為1－1.5×105cells/ml，48hr后長(zhǎng)成單層。

（4）培養(yǎng)基和血清的質(zhì)量可靠、穩(wěn)定；建議采用特級(jí)小牛血清。

（5）細(xì)胞及時(shí)傳代，不可以在老化后傳代，一般在剛長(zhǎng)成細(xì)胞單層時(shí)進(jìn)行傳代、擴(kuò)增。

（6）細(xì)胞傳代時(shí)消化液用0.25%+0.03%EDTA，消化過程應(yīng)盡量縮短在1～2分鐘內(nèi)完成。

二、 病毒感染、維持和收獲

轉(zhuǎn)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄瓶?jī)?nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入維持液，置37℃恒溫室轉(zhuǎn)瓶機(jī)上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)3－5天。

維持液：DMEM+4～5％新生牛血清。

pH應(yīng)為7.4～7.8；后期維持pH會(huì)慢慢降下來。

細(xì)胞病變時(shí)間出現(xiàn)在接毒后48小時(shí)，72～96小時(shí)細(xì)胞病變達(dá)80％左右，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%以上病變（CPE）時(shí)，即可開始收毒；反復(fù)傳過幾代后病變時(shí)間可縮短。

第3、4天注意觀察，細(xì)胞病變（CPE）達(dá)到80％時(shí)收獲病毒，－20℃凍融3次，混勻病毒懸液，96孔板測(cè)定TCID50。

收液時(shí)需要將含毒細(xì)胞反復(fù)凍融2～3次以破碎細(xì)胞，將病毒釋放到培養(yǎng)液中。

三、 細(xì)胞病變（CPE）

細(xì)胞在接種病毒后，24－48hr開始出現(xiàn)病變，72－96hr約達(dá)到80％病變。病變現(xiàn)象：細(xì)胞空泡化、圓縮、先灶狀脫落，再大片脫落，zui后整個(gè)細(xì)胞裂解、破碎。圖1是指PRRSV感染后，出現(xiàn)細(xì)胞病變的Marc 145細(xì)胞。

四、 PRRS病毒在細(xì)胞中增殖規(guī)律（ Virology Journal, 2006, 3: 90）

PRRS病毒感染Marc 145細(xì)胞過程可大致分為兩個(gè)感染階段，*階段：病毒感染細(xì)胞后的20－22hr左右，僅部分細(xì)胞被隨機(jī)感染，而且Marc 145細(xì)胞對(duì)PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）與MOI量無關(guān)，因?yàn)镸OI劑量比常規(guī)量提高100倍，感染22hr后，仍僅5.5%的細(xì)胞呈PRRSV陽(yáng)性（PRRSV-positive）。第二階段：感染后的2－3天（也稱為病毒的對(duì)數(shù)感染期），病毒感染蔓延是通過相鄰細(xì)胞和細(xì)胞之間的接觸感染，細(xì)胞對(duì)自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出現(xiàn)了感染細(xì)胞群。 感染過程如圖5所示。

對(duì)我們的一點(diǎn)啟示：可以采用適當(dāng)?shù)土康腗OI進(jìn)行病毒感染，比如0.05virus/cell；同時(shí)，大部分細(xì)胞在維持期的*天尚需繼續(xù)生長(zhǎng)，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，較長(zhǎng)的病毒維持期均需要供給豐富的營(yíng)養(yǎng)物資，可以相信：維持液的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)病毒增殖效率有非常重要的影響。