1、 溫度與時(shí)間的設(shè)置：
基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq dna酶仍有較高的催化活性)。
1. 變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的zui主要原因。DNA在其鏈分解溫度時(shí)的變性只需幾秒鐘,但反應(yīng)管內(nèi)達(dá)到Tss還需一定時(shí)間,變性溫度太高會(huì)影響酶活性;通常情況下93℃～94℃1min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。變性所需的加熱溫度取決于模板及PCR產(chǎn)物雙鏈DNA中的G+C含量。雙鏈DNA中的G+C的比率越高，則雙鏈DNA分離變性的溫度也就越高。變性所需的時(shí)間與DNA分子的長(zhǎng)度相關(guān)，DNA分子越長(zhǎng)，在特定的變性溫度下使雙鏈DNA分子*分離所需的時(shí)間就越長(zhǎng)。若變性溫度太低或變性時(shí)間太短，則只能使DNA模板中富含AT的區(qū)域產(chǎn)生變性，當(dāng)PCR循環(huán)中的反應(yīng)溫度降低時(shí)，部分變性的DNA模板又重新結(jié)合成雙鏈DNA，從而導(dǎo)致PCR的失敗。
2. 退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。復(fù)性溫度決定著PCR的特異性.引物復(fù)性所需的溫度與時(shí)間取決于引物的堿基組成、長(zhǎng)度和濃度。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。退火溫度一般低于引物本身變性溫度5℃。一般退火溫度在40～60℃之間，時(shí)間為30～45s，足以使引物與模板之間*結(jié)合。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇zui適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。如果(G C)低于50%，退火溫度應(yīng)低于55℃。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T) 復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
【引物長(zhǎng)度在15～25bp可通過公Tm=(G C)×4℃ (A T)×2℃計(jì)算退火溫度】:
較高的退火溫度可提高反應(yīng)的特異性。在Tm值允許范圍內(nèi)，應(yīng)盡量選擇較高的復(fù)性溫度。
3. 延伸溫度與時(shí)間：Taq dna聚合酶的生物學(xué)活性：70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子;70℃ 60核苷酸/S/酶分子;55℃ 24核苷酸/S/酶分子;高于90℃時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。
延伸溫度應(yīng)在Taq酶的zui適溫度范圍之內(nèi)，一般在70～75℃。常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸時(shí)間要根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度確定，通常對(duì)于1kb以內(nèi)的片段1min是夠用的。3～4kb的靶序列需3～4min;擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。
2、 循環(huán)數(shù)：
循環(huán)次數(shù)決定著擴(kuò)增的程度。在其它參數(shù)都已優(yōu)化的前提下，循環(huán)次數(shù)取決于zui初靶分子的濃度。循環(huán)次數(shù)過多會(huì)增加非特異性產(chǎn)物量及堿基錯(cuò)配數(shù)，此外還會(huì)導(dǎo)致PCR反應(yīng)“平臺(tái)效應(yīng)”的出現(xiàn);循環(huán)數(shù)太少會(huì)影響正常的PCR產(chǎn)物量。常規(guī)PCR一般為25-40周期較合適，具體要多少循環(huán)數(shù)可通過預(yù)試驗(yàn)確定。在其他參數(shù)交已優(yōu)化的條件下，zui適循環(huán)數(shù)取決于靶序列的初始濃度，模板DNA分子數(shù) 需要熱循環(huán)次數(shù)參照：
3.0×105 25-30
1.5×104 30-35
1.0×103 35-40
50 40-45
3、 PCR產(chǎn)物積累規(guī)律：
反應(yīng)初期產(chǎn)物以2n呈指數(shù)形式增加，至一定的循環(huán)數(shù)后，引物、模板、DNA聚合酶形成一種平衡，產(chǎn)物進(jìn)入一個(gè)緩慢增長(zhǎng)時(shí)期(“停滯效應(yīng)”)，即“平臺(tái)期”。到達(dá)平臺(tái)期所需PCR循環(huán)數(shù)與模板量、PCR擴(kuò)增效率、聚合酶種類、非特異產(chǎn)物竟?fàn)幱嘘P(guān).
