凝膠層析又稱凝膠過濾，是一種按分子量大小分離物質(zhì)的層析方法。該方法是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然后用緩沖液洗脫。大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒中的靜止相中，只留在凝膠顆粒之間的流動(dòng)相中，因此以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，并很快在流動(dòng)相和靜止相之間形成動(dòng)態(tài)平衡，因此就要花費(fèi)較長的時(shí)間流經(jīng)柱床，從而使不同大小的分子得以分離。

凝膠過濾柱層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以*或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而對(duì)某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數(shù)Kav（被分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系）表示。Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關(guān)，即：

Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)

在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值??；反之，則Kav值增大。

通常選用藍(lán)色葡聚糖2000作為測定外水體積的物質(zhì)。該物質(zhì)分子量大（為200萬），呈藍(lán)色，它在各種型號(hào)的葡聚糖凝膠中都被*排阻，并可借助其本身顏色，采用肉眼或分光光度儀檢測（210nm或260nm或620nm）洗脫體積（即Vo）。但是，在測定激酶等蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，宜用藍(lán)色葡聚糖2000測定外水體積，因?yàn)樗鼘?duì)激酶有吸附作用，所以有時(shí)用巨球蛋白代替。測定內(nèi)水體積（Vi）的物質(zhì)，可選用硫酸銨、N-乙酰乙酯，或者其它與凝膠無吸附力的小分子物質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)使用血紅蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－（DNP－分子量12,000左右）的混合物，通過Sephadex G－25層析后達(dá)到分離。

試劑和器材

一、試劑

0.9％ NaCl；10％ NaHCO3）；95％乙醇。

pH 7.0凝酸緩沖液（20mM：20mM＝31mL：69mL）

二、材料

血紅蛋白溶液（Hb）：取抗凝血（肝素）2mL，離心棄去上層血漿。用0.9％NaCl洗血細(xì)胞數(shù)次（顛倒混勻，離心，棄去上清液），使離心后上清液幾乎無淡黃色為止。于洗凈的紅細(xì)胞中加入5倍體積的蒸餾水搖勻，離心去沉淀（破碎的細(xì)胞膜等）即為Hb稀釋液備用。

DNP－溶液：取0.15g溶于10％NaHCO3溶液1.5mL中（此時(shí)該蛋白質(zhì)溶液pH應(yīng)在8.5～9.0左右）。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微熱的95％乙醇3mL中，待其充分溶解后立即傾入上述蛋白質(zhì)溶液中。將此管置于沸水浴中煮沸5分鐘，注意防止乙醇沸騰溢出。冷卻后加2倍體積的95％乙醇，可見黃色的DNP－沉淀。離心（300r/m）5分鐘，棄去上清液，沉淀用95％乙醇洗2次，所得沉淀用1mL蒸餾水溶解，即為DNP－溶液，備用。