一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、了解微生物分離和純化的原理；2、掌握常用的分離純化微生物的方法；3、掌握菌落特征的觀察。4、學(xué)習(xí)掌握微生物的幾種接種技術(shù) 5、 建立無(wú)菌操作的概念，掌握無(wú)菌操作的基本環(huán)節(jié)二、實(shí)驗(yàn)原理 從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體。因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個(gè)菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。 土壤是微生物生活的大本營(yíng)，它所含微生物無(wú)論是數(shù)量還是種類(lèi)都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場(chǎng)所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。本實(shí)驗(yàn)將采用不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不同類(lèi)型的微生物。 將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱(chēng)之為接種。接種是微生物實(shí)驗(yàn)及科學(xué)研究中的一項(xiàng)zui基本的操作技術(shù)。無(wú)論微生物的分離、培養(yǎng)、純化或鑒定以及有關(guān)微生物的形態(tài)觀察及生理研究都必須進(jìn)行接種。接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無(wú)菌操作，如操作不慎引起污染，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不可*，影響下一步工作的進(jìn)行。三、實(shí)驗(yàn)材料 1 培養(yǎng)基和菌種 淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號(hào)培養(yǎng)基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基，活性污泥混合液。普通瓊脂斜面和平板,營(yíng)養(yǎng)肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。大腸桿菌、。2 溶液或試劑 10%酚液，盛9ml無(wú)菌水的試管，盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。 3 儀器或其它用具 無(wú)菌玻璃涂棒，無(wú)菌吸管，接種環(huán)，無(wú)菌培養(yǎng)皿，和土樣，顯微鏡，、涂布器等。酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環(huán)、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。 四、實(shí)驗(yàn)步驟1、流程 倒平板→制備梯度稀釋液→涂布（或劃線法）→培養(yǎng)→挑單菌落→保存。 2、步驟 2.1稀釋涂布平板法 2.1.1 倒平板 將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化待冷至55～60℃時(shí)，高氏I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基中加入10%酚數(shù)滴，馬丁氏培養(yǎng)中加入溶液(終濃度為30μg/ml)，混合均勻后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。 倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹?，試管或瓶口保持?duì)著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。 2.1.2 制備活性污泥混合液稀釋液 稱(chēng)取土樣l0g，放入盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細(xì)胞分散。用一支lml無(wú)菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無(wú)菌水的大試管中充分混勻，然后用無(wú)菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此類(lèi)推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的活性污泥混合液溶液，注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換一支試管。 2.1.3 涂布 將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫(xiě)上10-4、10-5和10-6三種稀度，然后用無(wú)菌吸管分別由10-4、10-5和10-6，從三管活性污泥混合液稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對(duì)應(yīng)平板培養(yǎng)基表面位置。用無(wú)菌玻璃涂棒，右手拿無(wú)菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。室溫下靜置5～l0min，使菌液浸入培養(yǎng)基。 2.1.4 培養(yǎng) 將高氏I號(hào)培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于28℃溫室中培養(yǎng)3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)2～3d。 2.1.5 觀察并挑菌落將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落根據(jù)其大小、顏色、形狀等特征進(jìn)行觀察，之后根據(jù)菌落不同特征分別挑取少許細(xì)胞接種到上述三種培養(yǎng)基斜面上，分別置28℃和37℃溫室培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。