一、目的： 
1、學(xué)習(xí)抗原及抗體的制備方法 
2、學(xué)習(xí)試管凝集反應(yīng)的方法及效價(jià)的測(cè)定 
3、學(xué)會(huì)分析不同抗原（o抗原、H抗原）的方法 
二、實(shí)驗(yàn)原理 
將生物細(xì)胞或它們的磨碎物。提取物等注射到熱血?jiǎng)游矬w內(nèi)，動(dòng)物血液中可以產(chǎn)生與注射物起作用的物質(zhì)——抗體。能誘發(fā)抗體產(chǎn)生的注射物稱為抗原。含有抗體的血清稱為免疫血清或抗血清。抗原和抗體之間會(huì)發(fā)生各種血清學(xué)反應(yīng)，如凝集反應(yīng)，沉淀反應(yīng)等，它既?；置舾?，可用于鑒定和研究細(xì)菌等生物的親緣關(guān)系。 
三、實(shí)驗(yàn)器材及藥品 
1 U形管，試管 2 半固體培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基 3 接種環(huán) 4 高壓鍋 5 搖床 6 顯微鏡 7 離心機(jī) 8 0.25%甲醛生理鹽水等 
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 
1、 制備H-抗原 
（1）制備半固體培養(yǎng)基：成份：牛肉膏1%，蛋白胨1%，瓊脂0.4%，把半固體培養(yǎng)基裝入裝有U形玻璃管的試管中，15磅滅菌30min。 
（2）活化菌種：將菌種接在盛有半固體培養(yǎng)基的U形管一端，一天后發(fā)現(xiàn)菌株運(yùn)動(dòng)到另一端后迅速取出，轉(zhuǎn)接于第二支U形管中，如此3-5次。 
（3）搖床培養(yǎng)：從zui后一次活化管中取運(yùn)動(dòng)性zui強(qiáng)的菌株接入500nl成有肉湯培養(yǎng)基的搖瓶?jī)?nèi)，每瓶含100ml培養(yǎng)基，其成份為：牛肉膏1%，蛋白胨1%，水100ml。每瓶接上一接種環(huán)，稍弄散，避免集中，放入30度搖床振蕩培養(yǎng)9-10小時(shí)。 
（4）無(wú)菌檢查及離心：取出培養(yǎng)液，涂片，用品紅染色，顯微鏡油鏡檢查，若無(wú)其他雜菌時(shí)，裝入離心管3000轉(zhuǎn)/分離心15-20分鐘。倒去生理鹽水，收集沉淀懸浮于0.25%甲醛生理鹽水中。每塑料管用10ml甲醛生理鹽水洗下裝入試管，置冰箱待用。 
（5）制備抗體：實(shí)驗(yàn)室中制備抗血清都用家免，大量生產(chǎn)則用馬等。 
i. 動(dòng)物的準(zhǔn)備：免疫注射采用體重2-3公斤的健康雄免。把免子固定在特制的木盆內(nèi)，只留頭部在外，將雙耳邊緣附近的毛用刀片剃去，用75%酒精消毒，再用少量二甲苯試去耳翼使靜脈充血，取血少量，測(cè)定注射前的正常血清能否與測(cè)定的細(xì)菌發(fā)生凝集反應(yīng)。如不進(jìn)行了凝集反應(yīng)，則可用來(lái)作免疫注射。 
ii. 免疫注射：抗原嘗試采用麥?zhǔn)媳壬艿?管，采用5號(hào)針頭注射。注射方案如下：第1天0.5ml，第3天1ml，第5天1.5ml，第2天ml，第9天2.5ml。再過(guò)6天后進(jìn)行試血，當(dāng)效價(jià)達(dá)2000左右時(shí)，即可大量采血。若效價(jià)太低，可繼續(xù)補(bǔ)充注射。 
iii. 兔子放血：先把兔子固定在小動(dòng)物解剖臺(tái)上，剪去頸部毛和頸部皮膚，直至現(xiàn)出食管為止。仔細(xì)在食管兩側(cè)稍靠下部找也左右兩根頸動(dòng)脈，用線綁住附近頭端，再用鉗住，在細(xì)線與間用剪刀剪斷，再在兩鉗音剪斷，動(dòng)脈血就噴出，可用三角瓶接收。若要采用心臟取血法，則用9號(hào)注射針頭對(duì)準(zhǔn)家免以及跳動(dòng)zui激烈之筋骨刺入，進(jìn)行抽血。 
iv. 抗血清處理：室溫下使血液凝固，分出血清，并進(jìn)行了離心后再加1/10000硫柳汞置冰箱保存。把血清盛放在安培瓶中封口，貼上標(biāo)簽，置冰箱保存。 
3． 效價(jià)測(cè)定：用一種抗原與一種抗血清反應(yīng) 
（1）取14根小試管在試管架上成一排 
（2）用移液管加入生理鹽水，*管0.9ml，其余0.5ml。 
（3）用移液管吸0.1ml抗血清于*管，使之成1ml，再用另一支移液管從*管吸0.5ml至第二管，一直類推至第13管。再?gòu)牡?3管吸也0.5ml去掉，第14管作為對(duì)照。