實(shí)驗(yàn)前應(yīng)明確的問題

1. 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

2. 藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。切記!否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。

3. 時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測定OD值，輸入excel表，zui后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時(shí)候變得平坦了（到了平臺期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是的時(shí)間點(diǎn)（因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的zui明顯）。

4. 培養(yǎng)時(shí)間。200ul的培養(yǎng)液對于10的4~5次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。

5. mtt法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞數(shù)。做MTT時(shí)，盡量無菌操作，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。

6. 理論未必都是對的。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。

7. 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。

8. 避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)步驟

貼壁細(xì)胞：

1. 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2. 5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度，每孔100ul，設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況

3. 5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6. 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）

懸浮細(xì)胞：

1. 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ;②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 （儲存液100ug/ml，需預(yù)試尋找*稀釋度，1：10-1：20）;③需檢測物10ul;④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100ul 1640）。

2. 置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）

4. 離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。

5. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。