一、 灌膠

1. 把制膠器放在平穩(wěn)的臺面上。

2. 保持制膠器干燥，抬起兩側(cè)的羽狀開關(guān)放開卡門，平放，放進橡膠墊圈并緊扣。先把厚玻璃平板放入，再放兩側(cè)的墊片，后放入帶凹型的玻璃平板。

3. 緊緊合上卡門，同時按壓兩側(cè)的羽狀開關(guān)聽到“咔嚓”聲音。

4. 倒分離膠：將配好的分離膠溶液用加樣槍緩慢加入制膠玻板之間,直至液面達到卡門邊框下緣線處。小心用加樣槍將去離子水沿水平方向加入制膠板中的分離膠液面上，以防止膠液蒸發(fā)并保證膠面平整。聚合大約需要30mins。

5. 倒?jié)饪s膠：分離膠聚合后，倒掉去離子水，用濾紙吸去殘液。在玻板中加滿濃縮膠溶液，輕輕地插入合適的梳子，梳子的厚面向?qū)嶒炚撸苊猱a(chǎn)生氣泡。

30分鐘后，除去梳子，抬起兩側(cè)的羽狀開關(guān)放開卡門，拿出帶膠的制膠玻板。

6. 安裝電泳槽：按壓電泳槽夾具的開關(guān)使卡門松開，將玻璃夾板放入槽內(nèi)。注意，兩玻璃夾板的凹玻板均應與電泳槽內(nèi)芯接觸。如果每次只電泳一塊膠，另一套玻璃夾板必須用提供的有機玻璃板代替。

7. 樣品處理：在等待濃縮膠聚合時，可對樣品進行處理，在樣品中按1:1體積比加入上樣buffer，在100℃加熱3-5分鐘以使蛋白質(zhì)變性。

8. 加樣：在外水槽加電泳緩沖液至槽體的一半位置。放正槽體，繼續(xù)加注緩沖液，避免產(chǎn)生氣泡，使內(nèi)槽的水位均超過凹形板的缺口但低于方形板的上沿。用微量加樣器或普通加樣槍在梳井內(nèi)按預定順序加樣，加樣量通常為10～25μl。

9. 電泳：蓋好上蓋，在100—150V的電壓下電1—2小時，一般濃縮膠電壓80V20~30Min，分離膠120V80Min，到樣品指示劑到達玻璃板的下緣，關(guān)掉電源。取下玻璃夾板。用刀片或薄板將膠板玻璃橇開，用單面剃刀片將分離膠切掉，將凝膠板的左上角切掉一小角以標記樣品順序。

附錄

染色與脫色（考馬斯亮藍法）

1. 如上所述，將電泳好的凝膠板取出。手戴橡膠手套將凝膠小心移入染色器皿中。

2. 在染色皿中加入100ml考馬斯亮藍染液（含0﹒25﹪考馬氏亮藍R-250，45﹪甲醇，10﹪冰醋酸的水溶液），加蓋，在搖床上染色2小時。

3. 將染液倒回貯存瓶，反復使用。在染色皿中加入100ml脫色液（10﹪冰醋酸，45﹪甲醇），振蕩脫色3小時，也可反復更換脫色液，縮短時間。

膠的保存

用30﹪甲醇，7﹪乙酸，2-5﹪混合液振蕩處理1小時。

注意

1. 清洗玻璃板。玻璃板應清洗干凈，玻璃表面的油污會造成分離膠與濃縮膠界面的不平整。經(jīng)用去污劑洗滌后的玻璃板先用蒸餾水沖洗，再用紗布蘸乙醇擦拭玻璃表面。

2. 分離膠濃度的選擇。低濃度膠對大分子量蛋白質(zhì)分離效果好：高濃度膠對小分子量蛋白質(zhì)分離效果好。

3. TEMED的加入量。TEMED是促進丙烯酰胺聚合的加速劑。加*果隨試劑保存時間而變化。對于陳舊試劑，可適當多加。事實上，配制分離膠時每塊膠板按2滴加入，效果也不錯。

4. 電極緩沖液的配制。電極緩沖液的用量大、占體積、配制麻煩。如果經(jīng)常跑膠，可考慮配制5X濃度的濃縮液。方法如下：將144g和30﹒2gTris溶于1升蒸餾水中。使用時稀釋5倍。

5. 丙烯酰胺的毒性。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺都是神經(jīng)性毒劑，對皮膚有刺激作用。但在形成凝膠后則無毒。操作時應戴橡膠或塑料手套，盡量避免接觸皮膚，并注意實驗后洗手。

電轉(zhuǎn)印：

正極（在下方，紅色電極） 兩層濾紙 NC膜或PVDF膜 PAGE

膠 兩層濾紙 負極（在上方，黑色電極）

定電壓：10V, 40~60Min

注意：NC膜要放在正極，要用手或滾子壓走氣泡。

轉(zhuǎn)印完畢，將NC膜取出，室溫干燥30-60min，浸入1%BSA的PBS液中4℃過夜封閉。

2） 酶免疫染色

① 取出封閉液中NC膜，含0.05%Tween-20的PBS洗滌5次,1-2min/次。

加入1：400的抗CD59McAb10ml，37℃1h。

② 含0.05%Tween-20的PBS洗滌5次,1-2min/次

③ 加入1：4000的羊抗鼠IgG10ml，37℃1h。

④ 含0.05%Tween-20的PBS洗滌5次,1-2min/次

⑤ 加入含0.06%DAB和H2O2的底物液,顯色20-30min。

觀察條帶情況，判斷結(jié)果。

電泳槽一般可分為三類即：水平電泳槽，主要是進行核酸分子的瓊脂糖凝膠電泳;垂直電泳槽可以在小批量核酸電泳和蛋白電泳中使用;轉(zhuǎn)移電泳槽主要是進行蛋白樣品轉(zhuǎn)移的電泳儀。