影響E.coli 中蛋白表達(dá)量的因素除載體啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)以外,還有 質(zhì)?？截悢?shù)、質(zhì)粒穩(wěn)定性、mRNA結(jié)構(gòu)、密碼子的偏愛性和宿主菌的生長狀態(tài)等因素[58].由于 Vector NTI suitor7.0軟件模擬表達(dá),可知mRNA結(jié)構(gòu)和密碼子的偏愛性兩個(gè)影響因素不會造成表達(dá)困難,所以本實(shí)驗(yàn)的工作主要針對載體拷貝數(shù)、載體穩(wěn)定和宿主菌的生長狀態(tài).

本實(shí)驗(yàn)中重組表達(dá)質(zhì)粒PrP-pET-32a（+）不穩(wěn)定的原因可能是PrP對E.coli BL21（DE3）具有細(xì)胞毒性.pET-32a（+）來源于pBR-322,pBR-322源于ColE1.ColE1、pBR-322 、pET- 32a（+）都失去了分配功能區(qū)par.而天然質(zhì)粒具有功能區(qū)par,可以保證質(zhì)粒在每次細(xì)胞周期中準(zhǔn)確的進(jìn)行分離,并均等的分配到子代細(xì)胞中去.功能區(qū) par對質(zhì)粒PrP-pET-32a（+）的穩(wěn)定性是*的[4].缺少功能區(qū)par的pET-32a（+）質(zhì)粒在每次細(xì)胞周期中隨機(jī)分配到子代細(xì)胞中去,無細(xì)胞毒性時(shí)約98% E.coli BL21（DE3）會帶有質(zhì)粒（見《pET System Manual》34頁）.表達(dá)有細(xì)胞毒性蛋白的E.coli BL21（DE3）不具有生長優(yōu)勢,而且隨細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間的增加β-內(nèi)酰氨酶將逐漸釋放到溶液中去,破壞溶液中的AMP.【β-內(nèi)酰氨酶功能強(qiáng)大,細(xì)菌培養(yǎng)稀釋1000倍以后還能破壞幾乎所有的AMP（見《pET System Manual》33頁）】.這樣本不具有生長優(yōu)勢的表達(dá)菌又失去了選擇壓力,造成大部分新生細(xì)菌無質(zhì)粒,表現(xiàn)為表達(dá)困難.本實(shí)驗(yàn)證實(shí)約60%以上的細(xì)菌無質(zhì)粒.

鑒于以上原因,本實(shí)驗(yàn)將融合蛋白Trx-PrPC 27-30表達(dá)分成兩個(gè)階段,前一個(gè)階段為質(zhì)粒生長階段,主要保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性和提高質(zhì)粒的拷貝數(shù);后一個(gè)階段為融合蛋白表達(dá)階段,待細(xì)菌生長達(dá)飽和以后,誘導(dǎo)融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達(dá).

在溫度、AMP濃度、培養(yǎng)基等諸多影響質(zhì)粒PrP-pET-32a（+）穩(wěn)定性的因素中,以溫度影響zui為明顯.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,37℃條件下約60% 以上的細(xì)菌無質(zhì)粒PrP-pET-32a（+）,25℃條件下失去質(zhì)粒PrP-pET-32a（+）的細(xì)菌在約10%以內(nèi).其他條件不變,AMP濃度在 100 ug/ml以上細(xì)菌質(zhì)粒PrP-pET-32a（+）基本穩(wěn)定.隨AMP濃度增加平板上的菌落逐漸變小,表明AMP可抑制細(xì)菌生長.不同培養(yǎng)基對 PrP-pET-32a（+）的穩(wěn)定性無明顯影響,但TB培養(yǎng)基可提高蛋白表達(dá)量.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TB培養(yǎng)基比LB提高蛋白表達(dá)量約在5-10%之間.

本實(shí)驗(yàn)中PrP-pET-32a（+）穩(wěn)定性高則融合蛋白Trx-PrPC 27-30表達(dá)量高.

溫度因素是影響本實(shí)驗(yàn)融合蛋白表達(dá)量zui為明顯的因素.如圖2-9,37℃條件下,其他條件不管如何改變,都未見融合蛋白Trx-PrPC 27-30有明顯表達(dá)帶ColE1復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒,在加入以后可以抑制細(xì)菌蛋白的生長,但不抑制質(zhì)?？截悢?shù)的增加.雖然沒有文獻(xiàn)可以解釋這一現(xiàn)象,我們?nèi)钥梢酝茰y導(dǎo)致質(zhì)粒拷貝數(shù)增加的蛋白合成系統(tǒng)是獨(dú)立于細(xì)菌蛋白合成系統(tǒng)的,這個(gè)系統(tǒng)以一種相對穩(wěn)定速度合成質(zhì)粒.所以降低細(xì)菌生長速度可增加細(xì)菌質(zhì)?？截悢?shù)（并間接增加質(zhì)粒穩(wěn)定性）從而增加融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達(dá)量.本實(shí)驗(yàn)在37℃條件下,誘導(dǎo)前OD600 為0.6時(shí)開始誘導(dǎo),4 h誘導(dǎo)培養(yǎng) ,菌液的OD600 值可達(dá)5,未見融合蛋白Trx-PrPC27-30的明顯表達(dá);25℃條件下,誘導(dǎo)前OD600 為1.5,更換等體積新鮮TB誘導(dǎo)4h,菌液的OD600 值可達(dá)2.3,融合蛋白Trx-PrPC27-30的zui高表達(dá)量接近50%.變化如此之大,出乎意料.

AMP濃度是繼溫度條件以后,影響融合蛋白表達(dá)量的另一個(gè)重要因素.當(dāng)其他條件不變,AMP濃度在50 ug/ml以下時(shí),融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達(dá)量在20%以下;AMP濃度在200-500 ug/ml條件下,Trx-PrPC 27-30呈高表達(dá),表達(dá)量接近50%.但AMP濃度加到500 ug/mlAMP時(shí)則會使細(xì)菌的生長速度下降.說明一定的選擇壓力可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性從而提高融合蛋白表達(dá)量,200 ug/ml的AMP濃度為zui適表達(dá)濃度.

不同IPTG濃度對融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達(dá)量無明顯影響,0.1 mM的IPTG即可達(dá)到38%的表達(dá)量,1 mM IPTG可達(dá)zui高表達(dá)量;乳糖誘導(dǎo)條件下融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達(dá)量隨乳糖濃度增加而逐漸增加,但乳糖誘導(dǎo)融合蛋白Trx-PrPC27-30的zui高表達(dá)量（39.6%）比IPTG誘導(dǎo)的zui高表達(dá)量（45.7%）低.可能是由于乳糖提高了細(xì)菌的生長速度,間接降低了質(zhì)粒的拷貝數(shù),導(dǎo)致表達(dá)量下降.乳糖濃度太低時(shí),細(xì)菌在誘導(dǎo)表達(dá)早期已將乳糖消耗干凈,造成誘導(dǎo)不足;乳糖濃度太高,細(xì)菌的生長速度過快,降低了質(zhì)粒的拷貝數(shù),融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達(dá)量又有所下降.所以乳糖誘導(dǎo)表現(xiàn)為融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達(dá)量,隨乳糖濃度增加由低到高,然后又略有下降.當(dāng)其他條件不變時(shí),用3%乳糖誘導(dǎo)融合蛋白Trx-PrPC 27-30可達(dá)zui高表達(dá)量,而8%乳糖誘導(dǎo)表達(dá)量有所下降.

隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加融合蛋白Trx-PrPC 27-30的表達(dá)量均勻增加,3 h以后接近zui高表達(dá)量,過夜誘導(dǎo)zui高表達(dá)量可達(dá)47%,甚至接近50%.誘導(dǎo)過程中細(xì)菌OD600 變化不大,由1.5上升為2.0-2.5.與此不同的是,37℃誘導(dǎo)條件下,無融合蛋白Trx-PrPC 27-30表達(dá)時(shí),細(xì)菌OD600 值變化很大,誘導(dǎo)4 h,細(xì)菌OD600 值由0.6上升為5,表明細(xì)菌分裂并不是表達(dá)融合蛋白所需,甚至可導(dǎo)致蛋白表達(dá)量下降.細(xì)菌生長接近飽和以后,更換等體積新鮮培養(yǎng)基誘導(dǎo),可獲得高的蛋白表達(dá)量.