該方法是雙縮脲法的發(fā)展，包括兩步反應(yīng)：

（1）在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)—銅絡(luò)合物。

（2）此絡(luò)合物將試劑磷鉬酸—磷鎢酸（FolIn試劑）還原，混合物深藍(lán)色（磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此方法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100倍，定量范圍為5~100μg蛋白質(zhì)。FolIn試劑顯色反應(yīng)由、、半引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干擾作用。此方法的缺點(diǎn)是有蛋白質(zhì)的特異性影響，即不同蛋白質(zhì)因絡(luò)氨酸、含量的不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式。

一、儀器與用具

試管若干;刻度移液管05Ml 1支，1Ml 1支，10Ml 1支;定量加樣器;圓底燒瓶;冷凝管1套（帶橡膠管）;微量滴定管;小燒杯;微量進(jìn)樣器50μl 1支;721分光光度計(jì);恒溫水浴器;研缽;玻棒;離心機(jī);離心管。

二、試劑

Na2WO4·2H2O;Na2MoO4·2H2O;85%H3PO4;濃HCl;Li2SO4·H2O;溴水;指示劑;Na2CO3;NaOH;CuSO4·5H2O;酒石酸鉀鈉;牛血清白蛋白。所用試劑均為化學(xué)純或分析純。

三、方法

1. 試劑的配制

（1）堿性銅試劑（相當(dāng)于雙縮脲試劑）的制備首先配制A液：4%碳酸鈉（Na2CO3）溶液與0.2mol/L氫氧化鈉（NaOH）溶液等比例混合（2%Na2CO3，0.1Mol NaOH）;B液：1%硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶液與2%酒石酸鉀鈉溶液等比例混合（0.5%CuSO4·5H2O，0.1%酒石酸鉀鈉）。在使用前將A液與B液按50∶1的比例混合即成。此為Folin-酚試劑甲液，此試劑只能使用1天。

酚試劑（相當(dāng)于Folin試劑）的配備：稱取鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100g、鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）25g，加蒸餾水700Ml溶解于1500Ml的圓底燒瓶中。之后加入85%的H3PO450ml，濃HCl 100ml，安上回流裝置（使用磨口接頭，若用軟木塞或橡皮塞時(shí)，就必須用錫鉑紙包起來），使其慢慢沸騰10H。冷卻后加入硫酸鋰（Li2SO4·H2O）150g，水50ml，溴水2~3滴，不用回流裝置開口煮沸15min，以釋放出過量的溴。待冷卻后稀釋至1000ml，并過濾入棕色瓶中，密閉于冰箱中保存（冷卻后溶液呈黃色，倘若仍呈綠色，須再滴加數(shù)滴液體溴，繼續(xù)煮沸15min）。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NAOH溶液滴定，以作為指示劑，滴定終點(diǎn)由藍(lán)變灰，滴定后算出酸的濃度。使用時(shí)大約加水1倍，使zui終濃度相當(dāng)于1Mol/L H+酸，此為FolIn-酚試劑乙液（Folin試劑）。

在測定時(shí)要注意，因?yàn)榉釉噭﹥H在酸性條件下穩(wěn)定，但此實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)只在PH值為10的情況下發(fā)生，所以當(dāng)加酚試劑時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會使顯色程度減弱。

（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的配制 稱取25mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸餾水中，使zui終濃度為250μg/ml。

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1）取7支試管，編號后，分別加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用蒸餾水補(bǔ)足1Ml，使每管含蛋白量分別為0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg（必要時(shí)可做重復(fù)）。

（2）在每支試管中用定量加樣器加入5ml甲液，混勻，于30℃下放置10min。

（3）在每支試管中噴射加入0.5ml乙液，立即振蕩混勻，在30℃下保溫30min。