RNA酶保護(hù)試驗（（RNase Protection Assay,RPA）是通過液相雜交的方式，用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達(dá)的技術(shù)。與Northern雜交和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優(yōu)點：

1. 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進(jìn)行電泳，故損失小，提高了靈敏度。

2. 由于PCR擴(kuò)增過程中效率不均一和反應(yīng)“平臺”問題，基于PCR產(chǎn)物量進(jìn)行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒有擴(kuò)增過程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實性較高。

3. 由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進(jìn)行分析。

4. 步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過程。

5. RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無探針自身復(fù)性問題，無須封閉。

6. 一個雜交體系中可同時進(jìn)行多個探針雜交，無競爭性問題。

7. 檢測分子長度可以任意設(shè)置，靈活性大。

RPA的缺點是需要同位素標(biāo)記探針。

一、試劑準(zhǔn)備

1. GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。

2. 雜交緩沖液：PIPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。

3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl（pH7.4） 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A（10mg/ml） 8μl、RNase T1（250U/μl） 1μl，加DEPC H2O至2ml

二、操作步驟

1.反義RNA可由含T7或SP6啟動子的重組質(zhì)粒為模板制備，也可以用含啟動子的PCR產(chǎn)物為模板制備，本文介紹后者。

① 設(shè)計含T7啟動子的PCR引物

由于PCR產(chǎn)物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下游引物5’-端要含T7啟動子序列：

T7啟動子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物設(shè)計的其他要求與一般PCR引物的設(shè)計相同。PCR產(chǎn)物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設(shè)計時可考慮100-400bp長。采用巢式PCR，即先擴(kuò)增出一較長的片段，再以該片段為模板擴(kuò)增出較短的片段，以保證探針的特異性。

② PCR

先用上游引物和下游引物Ⅰ進(jìn)行PCR，再以PCR 產(chǎn)物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進(jìn)行二次PCR（具體操作參見PCR章節(jié)）。

③ 探針合成標(biāo)記與純化

在0.5ml 離心管中加入下列試劑：

RNasin （40U/μl） 0.5μl

GACU POOL GAC（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM） 2μl

[α-32P]UTP（10μCi/μl） 2.5μlDTT （二硫蘇糖醇，0.1M） 1μl

5×轉(zhuǎn)錄 buffer 2μl

模板（50ng/μl） 1μl

T7 RNA 聚合酶 （15U） 1μl

混合后，短暫離心，37℃保溫1hr。

加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl，37℃ 15min，然后75℃10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

加入：飽和酚 50μl

氯仿 50μl

酵母tRNA（2μg/μl） 4μl

DEPC H2O 100μl

室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100μl氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉(zhuǎn)移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl、預(yù)冷無水乙醇250μl，混勻后，-20℃靜置30min。4℃離心13500g×10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗滌，4℃離心13500g×2min，棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀，4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質(zhì)量。（參見本節(jié)電泳步驟）。

2.雜交

① RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1μg/μl。

② 取8μl RNA加入1-3μl探針（根據(jù)探針檢測結(jié)果調(diào)整）于0.5ml 離心管中。

③ 80℃保溫2min，然后40-45℃下雜交12-18hr。

3. 消化

① 雜交管于37 ℃保溫15min，加入RNase消化液，37℃保溫30min。

② 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻，37℃保溫10min。

③ 加入65μl飽和酚和65μl氯仿，混勻，室溫離心，10000g×2min。

④ 轉(zhuǎn)移上層液到另一0.5離心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl異丙醇，混勻后，置-20℃ 30min，4℃離心,135000g×10min。

⑤ 棄上清液，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀。

4、電泳與放射自顯影

① 配制凝膠：（50ml）

40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺（19：1） 6.25ml

5×TBE 10ml

尿素 24g

加H2O至50ml，溶解后加入25%過硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。

② 預(yù)電泳

以1×TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進(jìn)行預(yù)電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應(yīng)達(dá)2000v以上，功率設(shè)定為100w，溫度設(shè)為50℃。待膠板溫度達(dá)50℃時，暫停電泳，準(zhǔn)備加樣。

③ 加樣

將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80℃加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預(yù)電泳）。

④ 電泳結(jié)束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70℃曝光1-3天。暴光結(jié)束后，將X光片顯影、定影、水洗、晾干。

三、注意事項

1.本實驗大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。

2.RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA，當(dāng)探針與樣品之間有堿基錯配時，錯配位點也將被消化，因此會產(chǎn)生片段較小的雜交片段。因此進(jìn)行PCR時，采取盡量減少錯配的措施。

3、 同位素對RNA合成有一定影響，有時會產(chǎn)生非全長的探針。因此，標(biāo)記時間不宜過長。

4、 RNase消化液有時會產(chǎn)生過度消化而無檢測信號，可以將消化液稀釋10-100倍后使用。