一、elispot.html' target='_blank'>ELISPOT 技術(shù)簡(jiǎn)介

隨著酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用, 使體外檢測(cè)各種細(xì)胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應(yīng)答機(jī)制時(shí)以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)體液中游離的細(xì)胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或 CK 的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK 的水平。80 年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和 CK 分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對(duì)探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

ELISPOT 法源自ELISA ，又突破傳統(tǒng)ELISA 法，是定量ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們zui大的不同在于：

1、ELISA 通過(guò)顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。

2、ELISPOT 也是通過(guò)顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過(guò) CTL 公司的 ELISPOT 分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1 個(gè)斑點(diǎn)代表 1 個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（某些研究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率）。

3、由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)，ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從 20 萬(wàn) -30 萬(wàn)細(xì)胞中檢出 1 個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。

4、捕獲抗體為 BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。

二、ELISPOT 檢測(cè)原理

細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF 孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過(guò) CTL 公司生產(chǎn)的 ELISPOT 酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。

三、ELISPOT 分析儀的出現(xiàn)解決了以下問(wèn)題

1、哪些斑點(diǎn)是抗原特異性T 細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)具有進(jìn)一步分析價(jià)值），哪些是無(wú)關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)沒(méi)有T 細(xì)胞研究?jī)r(jià)值）?

2、斑點(diǎn)大小的意義?

3、在對(duì)不同細(xì)胞因子計(jì)數(shù)和分析時(shí)，如何定義斑點(diǎn)zui大和zui小尺寸?

4、如何從單個(gè)細(xì)胞基礎(chǔ)上分析?

5、實(shí)驗(yàn)度有多高?如果一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生相似的細(xì)胞因子，在多大程度上會(huì)干擾分析結(jié)果?6、幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)才能使結(jié)果更有意義?