注意事項(xiàng)

1、    如果在本產(chǎn)品中額外再加入終濃度為1×的、新鮮配制的蛋白酶抑制劑復(fù)合物，可以更有效地抑制蛋白酶活性，防止蛋白降解。

2、    如果用于信號傳遞研究，在本產(chǎn)品中加入終濃度為1×的、新鮮配制的磷酸酶抑制劑復(fù)合物。

3、    整個裂解步驟都要在冰浴或4℃操作。本產(chǎn)品和PBS均需預(yù)先冷卻。

4、    本產(chǎn)品所含有較高濃度的去垢劑會對Bradford蛋白濃度測定有較大影響，因此只能使用BCA法測定蛋白濃度。

一：處理貼壁的培養(yǎng)細(xì)胞

1、    去除貼壁細(xì)胞培養(yǎng)液，用冰浴預(yù)冷的PBS洗兩遍，去盡殘留的PBS。

2、    將培養(yǎng)板放置在冰上待用。

3、    按每10⁶個細(xì)胞加入0.1 mL本產(chǎn)品（或100mm貼壁細(xì)胞加1mL本產(chǎn)品）的比例向培養(yǎng)板中加入適量的本產(chǎn)品（按此比例裂解得到的裂解物的蛋白濃度約在5-10 mg/mL之間）。

注意：裂解效率跟細(xì)胞數(shù)量和本產(chǎn)品用量的比例密切相關(guān)。一般情況下6孔板的單孔（1～2×10⁶細(xì)胞）需要0.1~0.2 mL本產(chǎn)品；25 cm²培養(yǎng)瓶（3～6×10⁶細(xì)胞）需要0.3~0.6 mL；75 cm²培養(yǎng)瓶（1～2×10⁷細(xì)胞）需要1~2 mL。對于特別大或特別小的細(xì)胞，需要用戶摸索*用量。

4、    冰上放置10-30分鐘（*時間跟細(xì)胞系相關(guān)），其間偶爾輕輕搖晃或用槍頭輕輕吹打。

5、    將細(xì)胞培養(yǎng)板傾斜使上清液匯集在一端，并將其全部轉(zhuǎn)移到一個新的1.5 mL塑料離心管中。

6、    15,000×g，4℃離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的1.5 mL塑料離心管中，放置在冰上待用或放-80℃長期保存。注意：如果用于免疫沉淀，新鮮使用。

7、    使用前先測定上清液的蛋白濃度，然后再進(jìn)行后續(xù)的電泳、Western或免疫沉淀操作。

二：處理懸浮細(xì)胞

1、    400×g，4℃離心10分鐘收集懸浮細(xì)胞，棄上清。

2、    用等體積的預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞沉淀兩遍，步驟同*步。

3、    按每10⁶個細(xì)胞加入0.1 mL本產(chǎn)品的比例加入本產(chǎn)品，充分懸浮細(xì)胞。

4、    冰上放置15分鐘裂解細(xì)胞，期間偶爾輕柔震蕩。

5、    15,000×g，4℃離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的1.5 mL塑料離心管中。為避免吸取到細(xì)胞沉淀，留20-40uL液體不取。

6、    將上清液放置在冰上待用或放-80℃長期保存。注意：如果用于免疫沉淀，新鮮使用。

7、    使用前先測定上清液的蛋白濃度，然后再進(jìn)行后續(xù)的電泳、Western或免疫沉淀操作。

三：處理組織塊

1、    稱量組織塊，用毛玻片或玻璃勻漿器研磨或勻漿，用5-10倍體積的、預(yù)冷的PBS洗兩次（包括沖洗器材）。

2、    將勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管中，1500g、4℃離心5分鐘后棄上清。

3、    按每50 mg組織加入0.2 mL本產(chǎn)品的比例加入預(yù)冷的本產(chǎn)品，吹打混勻，放置冰上。

4、    每隔5分鐘振蕩器輕柔振蕩一次，共4次。

5、    15,000×g、4℃離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的1.5 mL塑料離心管中，放置在冰上待用或放-80℃長期保存。注意：如果用于免疫沉淀，新鮮使用。

6、    使用前先測定上清液的蛋白濃度，然后再進(jìn)行后續(xù)的電泳、Western或免疫沉淀操作。