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787次一、外標(biāo)準(zhǔn)模板DNA的制備
注:如果不需要自己制作濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,此步可省略。如果不使用外標(biāo)準(zhǔn)模板,只能使用根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
1、 挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落,如569B、El Tor N16961、O139 MO45等(注意:本產(chǎn)品A型需用O1霍亂弧菌做陽(yáng)性對(duì)照、B型需用O139霍亂弧菌做陽(yáng)性對(duì)照)于LB 液體培養(yǎng)基中,在
2、 用自選方法抽提培養(yǎng)的陽(yáng)性對(duì)照細(xì)菌的基因組DNA。注意:提取陽(yáng)性細(xì)菌的方法應(yīng)該與提取樣品細(xì)菌的方法相同。
3、 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化所得陽(yáng)性菌DNA的濃度和純度,并計(jì)算出DNA量跟陽(yáng)性細(xì)菌數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系,即1 ug 陽(yáng)性菌DNA對(duì)應(yīng)多少陽(yáng)性細(xì)菌。
4、 將純化的陽(yáng)性菌DNA 用超純水用10倍系列稀釋法稀釋成到7個(gè)濃度梯度(相當(dāng)于101-107 cfu/mL),充分混勻后放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
1、 用自選方法抽提樣品細(xì)菌的基因組DNA。注意:使用的方法應(yīng)該跟上步提取陽(yáng)性菌的方法相同。
三、熒光定量PCR(20uL體系)
1、 樣品管:在PCR管中加入下列成分:
成分 | 加入量 |
PCR MagicMix 2.0 | 10 uL |
PCR級(jí)綠如藍(lán)染料 | 1 uL |
待檢測(cè)樣品DNA(自備) | X |
O1專一性PCR引物對(duì)(僅本產(chǎn)品A型提供) 或 O139專一性PCR引物對(duì)(僅本產(chǎn)品B型提供) | 2 uL |
1×ROX染料 (自備、見(jiàn)注) | 2 uL |
補(bǔ)水到 | 20 uL |
注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對(duì)照,其他熒光PCR儀器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX作對(duì)照。
2、 陰性對(duì)照共兩管:一管用非霍亂弧菌的基因組DNA作為模板(可用實(shí)驗(yàn)室常用的BL21或DH5a大腸桿菌的基因組DNA);另一管用水作為模板。兩個(gè)陰性對(duì)照可以檢驗(yàn)PCR反應(yīng)的特異性。
3、 外標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)共七管:用上步制備的7個(gè)濃度梯度的陽(yáng)性菌DNA分別作為7個(gè)熒光PCR反應(yīng)的模板。
四、熒光PCR反應(yīng)參數(shù):
過(guò)程 | 溫度 | 時(shí)間 | 其他要求 |
預(yù)變性 | | 3 分鐘 |
|
PCR反應(yīng)一 (10個(gè)循環(huán)) | | 10 s |
|
| 20 s | 每次循環(huán)溫度降低 | |
| 15 s |
| |
PCR反應(yīng)二 (40個(gè)循環(huán)) | | 10 s |
|
| 20 s | 在此步收集反應(yīng)的熒光數(shù)據(jù),所選擇波長(zhǎng)見(jiàn)注。 | |
| 15 s |
|
注:本產(chǎn)品所用熒光染料跟DNA結(jié)合時(shí)的zui大光吸收是500nm,zui大發(fā)射波長(zhǎng)是530nm,不跟DNA結(jié)合時(shí)zui大吸收波長(zhǎng)是471 nm,無(wú)發(fā)射。
五、數(shù)據(jù)處理
1、 用7個(gè)濃度的陽(yáng)性菌標(biāo)準(zhǔn)樣品所得的數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,以細(xì)菌數(shù)的log為橫軸,以熒光PCR反應(yīng)的Ct值為縱軸。如果沒(méi)有自己制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以用本試劑的經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方程:Y=-3.68lg(X)+37.48, R2=0.99971。
通過(guò)樣品DNA熒光PCR的Ct值反推出待測(cè)樣品中的霍亂弧菌的數(shù)量:將樣品DNA熒光PCR的Ct值作為Y值放入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式中即可計(jì)算出X(PCR體系中霍亂弧菌的數(shù)量)。
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