一、外標(biāo)準(zhǔn)模板DNA的制備

注：如果不需要自己制作濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，此步可省略。如果不使用外標(biāo)準(zhǔn)模板，只能使用根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1、 挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落，如569B、El Tor N16961、O139 MO45等（注意：本產(chǎn)品A型需用O1霍亂弧菌做陽(yáng)性對(duì)照、B型需用O139霍亂弧菌做陽(yáng)性對(duì)照）于LB 液體培養(yǎng)基中，在37℃搖床培養(yǎng)10 小時(shí)，然后顯微鏡下計(jì)算細(xì)菌的濃度。注意：由于所有陽(yáng)性霍亂弧菌都有傳染性，所以本公司不提供，需要用戶自備。

2、 用自選方法抽提培養(yǎng)的陽(yáng)性對(duì)照細(xì)菌的基因組DNA。注意：提取陽(yáng)性細(xì)菌的方法應(yīng)該與提取樣品細(xì)菌的方法相同。

3、 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化所得陽(yáng)性菌DNA的濃度和純度，并計(jì)算出DNA量跟陽(yáng)性細(xì)菌數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即1 ug 陽(yáng)性菌DNA對(duì)應(yīng)多少陽(yáng)性細(xì)菌。

4、 將純化的陽(yáng)性菌DNA 用超純水用10倍系列稀釋法稀釋成到7個(gè)濃度梯度（相當(dāng)于10¹-10⁷ cfu/mL），充分混勻后放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

1、 用自選方法抽提樣品細(xì)菌的基因組DNA。注意：使用的方法應(yīng)該跟上步提取陽(yáng)性菌的方法相同。

三、熒光定量PCR（20uL體系）

1、 樣品管：在PCR管中加入下列成分：

注：僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對(duì)照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX作對(duì)照。

2、 陰性對(duì)照共兩管：一管用非霍亂弧菌的基因組DNA作為模板（可用實(shí)驗(yàn)室常用的BL21或DH5a大腸桿菌的基因組DNA）；另一管用水作為模板。兩個(gè)陰性對(duì)照可以檢驗(yàn)PCR反應(yīng)的特異性。

3、 外標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)共七管：用上步制備的7個(gè)濃度梯度的陽(yáng)性菌DNA分別作為7個(gè)熒光PCR反應(yīng)的模板。

四、熒光PCR反應(yīng)參數(shù)：

注：本產(chǎn)品所用熒光染料跟DNA結(jié)合時(shí)的zui大光吸收是500nm，zui大發(fā)射波長(zhǎng)是530nm，不跟DNA結(jié)合時(shí)zui大吸收波長(zhǎng)是471 nm，無(wú)發(fā)射。

五、數(shù)據(jù)處理

1、 用7個(gè)濃度的陽(yáng)性菌標(biāo)準(zhǔn)樣品所得的數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以細(xì)菌數(shù)的log為橫軸，以熒光PCR反應(yīng)的Ct值為縱軸。如果沒(méi)有自己制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用本試劑的經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方程：Y＝－3.68lg（X）＋37.48， R2=0.99971。

通過(guò)樣品DNA熒光PCR的Ct值反推出待測(cè)樣品中的霍亂弧菌的數(shù)量：將樣品DNA熒光PCR的Ct值作為Y值放入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式中即可計(jì)算出X（PCR體系中霍亂弧菌的數(shù)量）。