1．人中性粒細胞的細胞內pH測定

1）. 試劑

·中性粒細胞 （從人血液中提取）

·HEPES緩沖液

（153 mmol/l NaCl, 5 mmol/l KCl, 5 mmol/l 葡萄糖, 20 mmol/l HEPES, pH 7.4）

·BCECF-AM special packaging

·標定用緩沖液

（130 mmol/l KCl, 10 mmol/l NaCl, 1 mmol/l MgSO₄, 10 mmol/l Na-MOPS）

·Nigericin

2）. 染色及測定方法

a. 用HEPES制備細胞懸液，細胞濃度為4×10e7個/ml。

b. 加入1 mmol/l的BCECF-AM溶液，終濃度為3 µmol/l，在37℃下孵育30分鐘。

c. 用HEPES緩沖液充分清洗細胞外的BCECF-AM和凝集的中性粒細胞。

d. 用緩沖液將BCECF染色的細胞制成3×10e7個/ml的細胞懸液。

e. 取適量的細胞懸液，細胞數(shù)量為3×10e6個/ml，用熒光光度計測定熒光 （激發(fā)波長500 nm，發(fā)射波長530 nm）。

f. 在37℃下孵育10分鐘后，添加刺激藥物，記錄熒光強度的變化。

3）.標準曲線

a. 準確配制標定用緩沖液 （例如pH值：6.6、7.0、7.2、7.4、7.8、8.2 ）。

b. 從細胞懸液中取3×10e6個/ml細胞，離心清洗后用1 ml標定緩沖液混合，制成細胞懸液。

c. 加入nigericin終濃度為10 µg/ml，孵育約10分鐘后，測定熒光強度。

d. 橫軸為緩沖液的pH值，縱軸為熒光強度作圖。

2．注意事項

a. 若BCECF很難轉入細胞，可以同Fura 2一樣，用Pluronic F-127等表面活性劑。

b. 關于兩個激發(fā)波長，詳見參考文獻1）和5）。

c. 請先將nigericin用乙醇配制成2 mg/ml的儲備液。

關于細胞凋亡熒光染料Hoechst 33342 /PI 雙染 （2010-8-5）

關于Hoechst 33342

一、原理

正常情況下，熒光染料 Hoechst 33342 只有少量能透過細胞膜進入細胞，使其染上低藍色。但是當細胞發(fā)生凋亡時，它的細胞膜通透性增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342 比正常細胞的多，熒光強度要比正常細胞中要高。此外，凋亡細胞的染色體DNA 的結構發(fā)生了改變，從而使該染料能更有效地與DNA 結合，并且凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342 排出到細胞外使之在細胞內積累增加等都使凋亡細胞的藍色熒光增強。

二、激發(fā)波長和儀器

使用帶有350nm激發(fā)波長和460nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細胞。

三、毒性

Hoechst 33342對人體有害，請注意適當防護，操作時要十分小心，注意穿實驗服并戴一次性手套。

四、操作

1．對于固定的細胞或組織：
（1）對于細胞或組織樣品，固定后，適當洗滌去除固定劑。隨后如果需要進行免疫熒光染色，則先進行免疫熒光染色，染色完畢后再按后續(xù)步驟進行Hoechst 33342染色。如果不需要進行其它染色，則直接進行后續(xù)的Hoechst 33342染色。
（2）對于貼壁細胞或組織切片，加入少量Hoechst 33342染色液，覆蓋住樣品即可。對于懸浮細胞，至少加入待測染色樣品體積3倍的染色液，混勻。室溫放置3-5分鐘。
（3）吸除Hoechst 33342染色液，用TBST、PBS或生理鹽水洗滌2-3次，每次3-5分鐘。
（4）直接在熒光顯微鏡下觀察或封片后熒光顯微鏡下觀察。細胞發(fā)生凋亡時，會看到凋亡細胞的細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。
2。對于活細胞或組織：
（1） 加入適當量Hoechst 33342染色液，必須充分覆蓋住待染色的樣品，通常對于六孔板一個孔需加入1ml染色液，對于96孔板一個孔需加入100微升染色液。
（2）在適宜于細胞培養(yǎng)的溫度培養(yǎng)10-20分鐘。棄染色液，用PBS或培養(yǎng)液洗滌2-3次即可進行熒光檢測。

五、注意事項

（1）Hoechst 33342染色后的熒光會有淬滅現(xiàn)象，所以建議染色后在當天完成檢測，放置時間不宜過長。

（2）一般情況下，Hoechst 33342染料的濃度推薦為10-50μM。

六、同仁化學Hoechst 33342的優(yōu)點

（1）配制好的容液，減少操作步驟，減小對人體危害。該產品相對DAPI致癌性更小一下。

（2）可以和PI一起用于細胞凋亡檢測，染色后可看出細胞凋亡情況：正常細胞為低藍色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細胞為高藍色/低紅色（Hoechst33342++/PI+），壞死細胞為低藍色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）。

（3）對于活細胞，33342比33258穿透膜的能力更強一些。

（4）小包裝適用于老師做量小的實驗，不會造成試劑浪費。