富半*肝素結(jié)合蛋白61抗體說明書

siRNA小干擾RNA

l  *天：準(zhǔn)備細(xì)胞

健康的細(xì)胞是成功轉(zhuǎn)染的要求，在轉(zhuǎn)染前明確細(xì)胞的生存狀態(tài)

對(duì)于貼壁細(xì)胞：

1，吸棄培養(yǎng)基，用*、EDTA、或其他合適的方法分散細(xì)胞，在*化前，用無菌的1X PBS漂洗細(xì)胞2次。

2，一旦細(xì)胞分散，用4倍體積的含10% 胎牛血清不含抗生素的生長培養(yǎng)基（如DEME,RMPI1640）稀釋懸浮液 。

（注意：這個(gè)階段使用不含抗生素的培養(yǎng)基是轉(zhuǎn)染成功的關(guān)鍵）

3，1,000 rpm離心5分鐘，去除培養(yǎng)基，用不含抗生素的培養(yǎng)基重懸沉淀

4，轉(zhuǎn)移細(xì)胞到12孔的細(xì)胞培養(yǎng)板 以便細(xì)胞過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞覆蓋率達(dá)60-80%

（注意：細(xì)胞覆蓋率也是成功轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵）

對(duì)于懸浮細(xì)胞：

1，1,000 rpm離心5分鐘

2，去除培養(yǎng)基，用不含抗生素的含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基重懸沉淀

3，轉(zhuǎn)移細(xì)胞到12孔的細(xì)胞培養(yǎng)板或轉(zhuǎn)到多聚賴氨酸包被的8孔板中，以便細(xì)胞過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞覆蓋率達(dá)60-80%

（注意：多聚賴氨酸包被是使懸浮細(xì)胞黏附到板底必須的）

富半*肝素結(jié)合蛋白61抗體說明書

l  第二天

 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染

 注意：對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠胁煌牟僮鞑襟E，請(qǐng)根據(jù)試驗(yàn)需要選擇下面介紹的操作步驟。

l  對(duì)于蛋白和轉(zhuǎn)錄檢測(cè)

注意：當(dāng)在組織培養(yǎng)板中進(jìn)行不同劑量的siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)，轉(zhuǎn)染試劑和siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的用量需要與不同孔的表面積成比率。

1，對(duì)每一次轉(zhuǎn)染，在一個(gè)無菌的小管里準(zhǔn)備下面的混合物 這一步無關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)類型

 （A） 加3.6ul 10uM的siRNA到40ul siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，輕柔混合，在室溫中放置15分鐘 （注意：如果需要低濃度的siRNA，用siRNA稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋）

（B）加2.4ul siRNA轉(zhuǎn)染試劑到40ul的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，輕柔混合，室溫放置5分鐘。

注意：雖然siRNA轉(zhuǎn)染試劑對(duì)許多細(xì)胞都有很高的轉(zhuǎn)染效率，但并不是適用于所有的細(xì)胞

 2， 5分鐘后，混合A和B形成siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合物，輕柔混合，室溫孵育20分鐘。

 3， 然后，向每個(gè)含有siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合物的管中加入0.32ml的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，輕柔混合