抗普通大腸埃希菌菌體蛋白抗體，Anti-EPEC

（一）原理

葡萄球菌A蛋白（SPA）具有與多種哺乳動物IgG分子Fc段結(jié)合的能力，并與不同IgG亞類的結(jié)合力有所差別。改變pH及離子強(qiáng)度可洗脫結(jié)合于SPA-SepharoseCL-4B 柱上的IgG或不同的IgG 亞類，可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體。
（二）操作步驟
用0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝膠，15min。按1g干膠200ml上述緩沖液充分洗滌凝膠，（用玻璃漏斗過濾或置燒杯中洗滌）。
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裝柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液平衡。標(biāo)本可用硫酸銨粗提物，先10000g離心除去雜質(zhì)，必要時(shí)用0.22μm濾膜過濾，上樣前用1mol/L pH9.0 Tris 液調(diào)整標(biāo)本液pH至8.1或?qū)ζ胶庖和肝鲞^夜。
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加樣，一般按25～30mg IgG/g濕膠比例加樣，室溫作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸緩沖液充分淋洗，到淋洗液OD值為<0.02。
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用不同pH的枸櫞酸洗脫液洗脫，流速20ml/h。如純化小鼠IgG1一般用pH6.0;純IgG2a用pH4.0；純化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸鹽緩沖液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl緩沖液洗脫。
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用pH3.0或4.0洗脫液洗脫時(shí)，用適量固體Tris直接中和含有IgG的洗脫液。
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收集洗脫液測OD值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要透析除鹽后進(jìn)行濃度、純度和活性測定。
（三）試劑器材
（1）SPA-Sepharose L-4B （pharmacia）
（2）磷酸緩沖液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3
（3）枸櫞酸緩沖液 0.1mol/LpH6.0 0.1mol/LpH4.0   +0.02%   NaN30.1mol/LpH3.0 
（4）1mol/L pH9.0 Tris溶液
（5）再生緩沖液：①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl調(diào)整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸鈉含0.5mol/L NaCl調(diào)整pH至4.5+0.02%NaN3。
（四）注意事項(xiàng)
（1）SPA-Sepharose CL-4B凝膠價(jià)格昂貴，可再生后反復(fù)使用10～20次左右。方法：先用10倍柱體積0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白；再用10倍柱體積0.1mol/L pH4.5醋酸鈉緩沖液含0.5mol/L NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白；0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液平衡，4℃貯存。
（2）SPA-Sepharose CL-4B親 合層析法還可用于：①除去抗體液中IgG,檢測非IgG抗體（如IgM）的生物學(xué)活性；②除去木瓜蛋白酶或*水解IgG后的Fc段；③吸收或純化免疫復(fù)合物。
（3）狗、貓的多克隆IgM和IgA以及單克隆IgA和IgM也具有與SPA結(jié)合的能力。

抗普通大腸埃希菌菌體蛋白抗體，Anti-EPEC