辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗人可溶性纖維蛋白原抗體IgG

制備過程

1、免疫動(dòng)物 免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的 過程。 一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射。 抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞^[1]。

2、細(xì)胞融合 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。 將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。

3、選擇性培養(yǎng) 選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-*-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-*-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長(zhǎng)期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤*磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。

4、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化 在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識(shí)別抗原的表位及其分子量后，及時(shí)進(jìn)行凍存。

5、單克隆抗體的大量制備 單克隆抗體的大量制備重要采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。

（1）體內(nèi)誘生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

（2）體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。近年來，各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。