成像模式
相對(duì)于普通的Epifluorescence(EPI)/模式，Nanoimager有total internal reflection fluorescence (TIRF)/ highly inclined and laminated optical sheet (HILO)兩種模式可自由切換。
EPI：激發(fā)較厚的樣品（＞10um），信號(hào)噪聲強(qiáng)，即傳統(tǒng)模式。
TRIF：激發(fā)薄層樣品（＜200nm），信號(hào)噪聲弱，適用于膜表面成像。
HILO：激發(fā)樣品厚度（＜10um），信號(hào)噪聲較弱，適用于大部分成像。
應(yīng)用領(lǐng)域
單分子示蹤 | 單分子成像 | 蛋白質(zhì)相互作用 |
蛋白質(zhì)組裝 | 表觀遺傳學(xué) | DNA納米定位 |
單分子定位 | 單分子FRET | 外泌體 |
應(yīng)用案例
1、單分子FRET
Nanoimager是目前*臺(tái)用于大視野單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的商業(yè)化儀器。 FRET是一種兩個(gè)熒光分子間非輻射性的能量轉(zhuǎn)移方式，反映兩者的分子間距。 FRET一般在2 – 10 nm的間距發(fā)生。 smFRET研究中，作為供體的熒光分子由激光激發(fā)，將能量轉(zhuǎn)移至臨近的受體熒光分子。被激發(fā)的受體將能量以熒光形式發(fā)散。供體與受體可以連接至同一個(gè)或者不同的分子。
smFRET可以用于測(cè)量核酸或者單個(gè)蛋白分子的分子內(nèi)距離，也可以用于研究蛋白亞基間的相互作用；還可應(yīng)用于研究藥物對(duì)于酶結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)的作用，或是神經(jīng)退行性疾病中蛋白的聚集。 smFRET可以用于在單分子層面推到結(jié)合常數(shù)、反應(yīng)途徑與停滯時(shí)間而不受總體平均值干擾。
Nanoimager適用于smFRET的關(guān)鍵功能包括：同時(shí)雙色成像；單分子散射光強(qiáng)度和總體平均的實(shí)時(shí)分析；視野中數(shù)千個(gè)單分子的高通量成像，以及用交替熒光激發(fā) (ALEX) smFRET的功能來定量化學(xué)計(jì)量與FRET效率。圖4是smFRET用于研究單個(gè)DNA霍利迪交叉的動(dòng)力學(xué)。
用smFRET檢測(cè)霍利迪交叉(HJs)的實(shí)時(shí)構(gòu)象變化
2、單分子示蹤
Nanoimager可以在兩個(gè)通道同時(shí)示蹤細(xì)胞或者純化物樣品中的單分子 (圖5)，并計(jì)算擴(kuò)散系數(shù)。細(xì)胞中分子的擴(kuò)散系數(shù)可以被示蹤，如酶或蛋白可以通過藥物和抗生素的反應(yīng)來示蹤。低擴(kuò)散率可以表示標(biāo)記分子與另一分子或結(jié)構(gòu)的相互作用或相結(jié)合。同時(shí)示蹤兩種標(biāo)記了不同熒光分子的分子可以確定兩者動(dòng)態(tài)相互作用的水平。
Nanoimager可以直接反映純化樣品中熒光粒子的擴(kuò)散率和預(yù)估大小，具有敏感性 (單熒光分子級(jí)別) 和特異性 (雙色標(biāo)記可以顯著降低檢測(cè)雜質(zhì)的可能性)。
Nanoimager雙色追蹤單分子/粒子
3、使用Nanoimager成像—更大的視野
Nanoimager的每個(gè)成像通道均有50 µm x 80 µm的大視野，而其他大部分單分子顯微設(shè)備只有20µm x 20 µm的視野。視野中照明均勻，可以實(shí)現(xiàn)單分子或細(xì)胞的高通量成像并快速收集數(shù)據(jù)。
下圖顯示了以10倍于其他技術(shù)的速度對(duì)突變的大腸桿菌細(xì)胞的不同表型進(jìn)行成像。為了獲得不同表型的可靠的結(jié)果，需要對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行比較。使用具有大視野，能夠自動(dòng)對(duì)焦和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的Nanoimager可以顯著加快整個(gè)實(shí)驗(yàn)速度和通量。將大視野與超分辨成像結(jié)合是Nanoimager的*優(yōu)勢(shì)。
Nanoimager的大視野可以在高分辨率下實(shí)現(xiàn)高通量成像
規(guī)格及參數(shù)：
1、數(shù)據(jù)獲取分析：
分 辨 率 橫向分辨率<20nm；縱向分辨率<50nm
成像總數(shù) 可配置4激光
視 野 每個(gè)通道50μm×80μm
獲取速度 100fps/幀
3D成 像 像散成像
成像速度 數(shù)秒～數(shù)分鐘
2、操作參數(shù)：
聚焦模式 單次自動(dòng)對(duì)焦/連續(xù)自動(dòng)聚焦
穩(wěn) 定 性 <1 μm/K的漂移；<1 nm (1 Hz to 500 Hz)振幅
照射模式 TRIF /HILO
溫度控制 自動(dòng)補(bǔ)償
環(huán)境監(jiān)控 陣列傳感器
3、硬件參數(shù)：
規(guī) 格 21 cm x 21 cm x 15 cm
相 機(jī) 新sCMOS
物 鏡 油鏡 NA=1.4～1.49
激 光 器 DPSS 和二極管
激光類型 紫色: 405 nm (150 mW)
藍(lán)色: 473 nm (300 or 1000 mW), 488 nm (200 mW)
綠色: 532 nm (300 or 1000 mW), 561 nm (200 or 300mW)
紅色: 640 nm (300 or 1000 mW) 近紅外: 730 nm (300 or 1000 mW)
樣 品 臺(tái) 20/20/10 mm XYZ移動(dòng)范圍，1 nm精度的閉合壓電平臺(tái)
工 作 站 內(nèi)存＞32GB，顯卡GeForce GTX 1080/m
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