本試劑盒僅供研究使用
檢測范圍：5 ng/ml – 320 ng/ml
zui低檢測限：2 ng/ml
特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人BALP，且與其他相關蛋白無交叉反應。
有效期：6個月
預期應用：ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關生物液體中BALP含量。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結果造成任何影響。
概述
堿性磷酸酶（ALP或AKP）是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經肝臟向膽外排出的一種酶。但它不是單一的酶，而是一組同功酶。目前已發(fā)現(xiàn)有 AKP1、AKP2、 AKP3、AKP4、AKP與AKP6 六種同功酶。其中第 1、2、6 種均來自肝臟，第 3 種來自骨細胞，第 4 種產生于胎盤及癌細胞，而第 5 種則來自小腸絨毛上皮與成纖維細胞。血清中的骨堿性磷酸酶的濃度被認為反映了成骨細胞的代謝活性，而骨代謝的評價對于明確骨代謝病的嚴重程度和治療反應有著重要意義。因此在變形性骨炎、骨軟化、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、腎性骨營養(yǎng)不良、骨質疏松和骨轉移瘤中，血清骨堿性磷酸酶水平的檢測有著用武之地。骨堿性磷酸酶的測定就被應用于變形性骨炎診斷和病情的檢測。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗BALP抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗BALP抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的BALP呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）： 一塊（96孔）。
2. 標準品（Standard）： 2瓶（凍干品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）： 1×20ml/瓶。
4. 生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）： 1×10ml/瓶。
5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent） 1×10ml/瓶。
6. 生物素標記抗體（Biotin-antibody）： 1×120μl/瓶（1：100）。
7. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）： 1×120μl/瓶（1：100）。
8. 底物溶液（TMB Substrate）： 1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）： 1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液（Stop Solution）： 1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標準規(guī)格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof管
5. 系列可調節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存
1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8°C 1000 g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
標本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。
標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為320 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋320 ng/ml，160 ng/ml，80 ng/ml，40 ng/ml，20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內配制。
如配制160 ng/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）320 ng/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
生物素標記抗體的稀釋原則：
臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標記抗體加990μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：
臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制），37℃,60分鐘。
3. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。
5. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內進行檢測。
實驗備注
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
