彗星電泳法檢測(cè)細(xì)胞損傷試劑盒說(shuō)明書(shū)

時(shí)間：2012/10/25閱讀：3120

彗星電泳法檢測(cè)細(xì)胞損傷試劑盒

彗星法 DNA 損傷檢測(cè)試劑盒

（ Comet Assay for DNA Damage Detection Kit）

Cat number：KGA For Research Use Only

Store at4℃ for one year

Expire date：

一、試劑盒說(shuō)明

DNA在自由基（如·OH）的攻擊下容易發(fā)生損傷，即脫氧戊糖遭到破壞，磷酸二脂鍵的斷裂，堿基的破壞或脫落，便可進(jìn)一步產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂。將細(xì)胞固定于低熔點(diǎn)瓊脂糖中，取少量細(xì)胞涂在載玻片上，用堿高鹽溶液破壞細(xì)胞膜，再用堿溶液使DNA分子解旋。將載玻片置于電泳液中，在電場(chǎng)的作用下，DNA分子向陽(yáng)極移動(dòng)。如果DNA損傷嚴(yán)重，碎片多，則電泳速度快。未受損傷的DNA大分子則由于細(xì)胞膜的阻隔，滯留在原處。用PI染色或銀染，可觀察到DNA受損的細(xì)胞形同彗星現(xiàn)象，作定性分析。也可用相關(guān)的軟件作定量分析。

二、試劑盒組份

組份	Cat: KGA240（20 assays）	儲(chǔ)存條件
Lysis Bufffer	100 mL	4℃
DMSO	8 mL	4℃
正常熔點(diǎn)瓊脂糖NMA	30 mg	4℃
低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA	30 mg	4℃
Propidium Iodide （PI）	400μL	4℃避光

三、 Kit以外自備儀器和試劑

低速離心機(jī) 、水平電泳儀、熒光顯微鏡、37⁰C、45⁰C水浴、載玻片、蓋玻片、平皿、微量移液器、1.5m L Microtube、0.4mmol/LTris-HCl（pH7.5）緩沖液、PBS

四、注意事項(xiàng)

Propidium Iodide （PI）和EB有毒，操作時(shí)要戴手套。

五、操作方法

1．細(xì)胞用冰冷的PBS洗一次，離心收集，用PBS重懸使其密度為1×10⁶個(gè)/mL；

2．鋪膠： 下述各濃度瓊脂糖凝膠均用PBS配制

第1層凝膠的制備：:將載玻片的磨砂面向上，40℃預(yù)熱，將預(yù)熱45℃的100μL的0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖（NMA）鋪于載玻片上，蓋上干凈的蓋玻片，再置4℃下10min使NMA凝固。

第2層凝膠的制備：:將10μL細(xì)胞（約 10^{4個(gè)）和75μL的0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA（在37℃下水浴加熱至少20min使之*溶化）混合均勻。然后，輕輕揭去蓋玻片，迅速將含細(xì)胞的LMA滴到第1層瓊脂糖上，立即蓋上另一干凈蓋玻片，置4℃10min使第2層LMA凝固。}

第3層凝膠的鋪制：:第2層LMA凝固后，在室溫下小心移去蓋玻片，滴加預(yù)熱37℃的75μL的0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA，如上蓋上蓋玻片4℃下凝固（第三層覆蓋第二層周圍0.5mm，增加凝膠化作用時(shí)間至30min，高濕度環(huán)境）。

3．細(xì)胞裂解 移去蓋玻片，將玻片置于平皿中,倒入預(yù)冷的Lysis Bufffer （使用前每9 mL加入1 mL的DMSO）， 4℃裂解1～2h，取出載玻片用PBS漂洗。

4．DNA堿解旋 將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的堿性電泳緩沖液（用戶自備1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH），約覆過(guò)載玻片膠面0.25cm左右，室溫放置20～60min，以便使DNA在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段，使DNA斷鏈在電場(chǎng)中易于遷移。

5．單細(xì)胞電泳 在電壓25V，電泳20～30min，電壓、電流可用改變緩沖液面高低來(lái)調(diào)節(jié)。

6．中和與染色 電泳后將載玻片置于平皿內(nèi)。加入0.4mmol/LTris-HCl（pH7.5）緩沖液，將載玻片沒(méi)入，4℃中和三次，每次10min，棄去Tris-HCl緩沖液，每載玻片加20μL的PI染液或EB染液，蓋上蓋玻片，避光染色10min。

7．觀察、拍照和分析熒光顯微鏡515～560nm波長(zhǎng)的激發(fā)光、PI染色的DNA圖象呈紅色，EB染色的DNA圖象呈桔紅色，可清楚地觀察到核DNA和遷移的DNA（即慧星尾）。每個(gè)樣本隨機(jī)選擇100個(gè)細(xì)胞，測(cè)定核DNA直徑和DNA遷移的長(zhǎng)度，可并用相應(yīng)的軟件分析。DNA損傷按彗星尾部DNA量占全部DNA量的比例分為5級(jí)： 0級(jí)：＜ 5% 無(wú)損傷； 1級(jí) 5~20% 輕度損傷；2級(jí) 20~40% 中度損傷；3級(jí) 40~95% 高度損傷；4級(jí) ＞95% 重度損傷

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