（一）A、腺病毒載體構(gòu)建：

本系統(tǒng)是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA為骨架，在克隆、包裝、擴(kuò)增等各部條件做了改進(jìn)和優(yōu)化，達(dá)到了克隆陽性率更高、質(zhì)量更可靠、包裝穩(wěn)定、出毒迅速、滴度高等效果。在此基礎(chǔ)上，還拓展了更廣泛的應(yīng)用，可以提供各種帶報(bào)告基因的，帶不同標(biāo)簽的腺病毒構(gòu)建和包裝服務(wù)。所包裝的腺病毒已成功應(yīng)用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因轉(zhuǎn)位，Co-IP，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，干細(xì)胞研究等科研實(shí)驗(yàn)。并且可以完成較高

詳細(xì)介紹

一、技術(shù)路線：

（一）A、腺病毒載體構(gòu)建：

本系統(tǒng)是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA為骨架，在克隆、包裝、擴(kuò)增等各部條件做了改進(jìn)和優(yōu)化，達(dá)到了克隆陽性率更高、質(zhì)量更可靠、包裝穩(wěn)定、出毒迅速、滴度高等效果。在此基礎(chǔ)上，還拓展了更廣泛的應(yīng)用，可以提供各種帶報(bào)告基因的，帶不同標(biāo)簽的腺病毒構(gòu)建和包裝服務(wù)。所包裝的腺病毒已成功應(yīng)用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因轉(zhuǎn)位，Co-IP，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，干細(xì)胞研究等科研實(shí)驗(yàn)。并且可以完成較高難度的克隆構(gòu)建，包括具有細(xì)胞毒性作用基因的腺病毒構(gòu)建，在短時(shí)間內(nèi)完成從原始質(zhì)粒到病毒DNA的構(gòu)建工作。

克隆目的基因到穿梭載體（中介載體）及鑒定

根據(jù)客戶提供的原始質(zhì)粒信息確定克隆方案：

如果原始質(zhì)粒與本系統(tǒng)所用穿梭載體有匹配酶切位點(diǎn)，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片斷，回收并連接到穿梭載體。酶切，測序鑒定；
如果原始質(zhì)粒與本系統(tǒng)所用穿梭載體沒有匹配酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)帶有特殊接頭的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片斷，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片斷，回收并連接到穿梭載體。酶切，測序鑒定；
對于不適用于以上方案或者有特定要求的樣品，與客戶協(xié)商定制具體實(shí)施方案

2）克隆目的基因到腺病毒載體pAdPL及鑒定

利用重組技術(shù)將目的片段的表達(dá)框從穿梭載體轉(zhuǎn)移到腺病毒載體。

酶切鑒定陽性克隆，將陽性克隆測序二次鑒定。

B、慢病毒載體構(gòu)建

慢病毒（Lent virus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，達(dá)到持久性表達(dá)的效果?？捎行У馗腥旧窠?jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

（二）病毒包裝、擴(kuò)增：

將鑒定正確的基因克隆到慢病毒載體，與輔助載體一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行包裝；
將包裝好的病毒超速離心收集；
將濃縮病毒進(jìn)行滴定，滴定結(jié)果單位為PFU/ml（一般為5×108 PFU/ml以上，體積為500μl以上，根據(jù)客戶需要，不同量有價(jià)格差異），慢病毒包裝4500.00/ml過表達(dá)，2500.00/ml干擾

二、質(zhì)量控制與鑒定：