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上海鼎杰生物科技有限公司
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閱讀:1425發(fā)布時(shí)間:2011-12-10
1、取組織塊(0.2~1g)zui少可到2~5mg在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,稱重,放入5或10ml的小燒杯內(nèi)。
2、用移液管量取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(pH7.4,0.01mol/L Tris-HCl,0.0001mol/L EDTA-2Na,0.01mol/L 蔗糖0.8%的氯化鈉溶液)或者用0.86%冷生理鹽水,勻漿介質(zhì)或者生理鹽水的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍,用移液管或移液器取總量2/3的勻漿介質(zhì)或生理鹽水于燒杯中,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(天熱時(shí)操作要在冰水浴中進(jìn)行,將盛有組織的小燒杯放入冰水中)。
3、勻漿的方式有多種:手工勻漿,機(jī)器勻漿,超聲粉碎,反復(fù)凍融。
①手工勻漿:將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中,再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或冷生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊,一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿,左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗桿垂直插入套管中,上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次(6~8分鐘),充分研碎,使組織勻漿化。
②機(jī)器勻漿:用組織搗碎機(jī)10000~15000r/min上下研磨制成10%組織勻漿,也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)設(shè)備(勻漿時(shí)間10秒/次,間隙30秒,連續(xù)3~5次,在冰水中進(jìn)行),皮膚、肌肉組織等可延長(zhǎng)勻漿時(shí)間。
③超聲粉碎:用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎,也可用國(guó)產(chǎn)超聲波發(fā)生儀,用400安培,5秒/次,間隙10秒反復(fù)3~5次。
④反復(fù)凍融:培養(yǎng)或者分離的細(xì)胞可以用以上①②③的方法勻漿,也可以反復(fù)凍溶3次左右(即讓細(xì)胞加適量的低滲液或者雙蒸水放低溫冰箱中結(jié)冰,溶解,再結(jié)冰,再溶解,反復(fù)3次左右),但有部分酶活力會(huì)受影響。
⑤取少量組織勻漿作涂片(直接涂片、染色均可以),顯微鏡下觀察細(xì)胞是否磨破,若沒(méi)有破則可延長(zhǎng)勻漿時(shí)間或增加凍溶次數(shù)(此步可省略)。
4、將制備好的10%勻漿用普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī)2000r/min左右離心10~15分鐘,若檢測(cè)ATP酶,則只需要1000轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘,將離心好的勻漿留上清棄下面沉淀。
根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要,取適量上清液進(jìn)行各種測(cè)定。
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