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血漿中C的ELISA測定
點擊次數(shù)：161 發(fā)布時間：2013-2-19
實驗原理
將抗C單克隆抗體包被固相聚苯乙烯板，加入經(jīng)聚乙二醇（PEG）處理的待測樣本，然后依次加入兔抗人C-IgC多克隆抗體和過氧化物酶標(biāo)記的豬抗兔IsC，再加入底物2，2’-連氮-雙（3-乙基苯駢唑啉-6-磺酸鹽）（ABTS）和H2O2顯色，于酶標(biāo)儀405mn處測定每分鐘光密度增加量（OD/min），以O(shè)D/min為縱坐標(biāo)，C標(biāo)準(zhǔn)晶濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，求出待測樣本中C的含量。
實驗試劑
1. PBSPH7.2，9mmol/L磷酸鹽緩沖液含140mmol/L NaCl。
2. PBS-Tween pH7.2 PBS含0.05％Tween20，簡稱PBS-T。
3. 底物溶液：100mL 2mmol/L ABTS溶液中含100mmol/L醋酸鈉，50mmol/L磷酸鈉，2.5mmol/L H2O2。
4. 沉淀劑：①：100mL pH8.0，20mmoL/L Tris-*-HCl緩沖液中含20g PEG 4 000，0.8g Rivanol；沉淀劑②：100mLpH2.0.100mmol／L*-HCl緩沖液中含20g PEG4000。
實驗步驟
1. 用鹽和/或PEG沉淀血漿中C5：在微量反應(yīng)板中加入EDTA抗凝血漿100gL，然后加人100/uL沉淀劑，用下述三種方法中任何一種沉淀血漿中C5。
1） 在微量反應(yīng)板中加入100uL 2mol/L HCl與100uL EDTA抗凝血漿混合，室溫5h。加入HCl后血漿pH值在1.0-1.5之間。上清用4倍體積的0.29mol/L Tris調(diào)節(jié)至pH7.1-7.4。
2） 在微量反應(yīng)板中加入100uL沉淀劑①，室溫30min。
3） 在微量反應(yīng)板中加入100uL沉淀劑②（血漿pH值在4.0-4.5之間）。室溫30min。用方法2）和方法3）沉淀C5后，上清加入4倍體積的含0.05％Tween 20 pH7，10.21mol/L Tris-HCl緩沖液，血漿被稀釋10倍。
2. 用抗C單克隆抗體（McAb）包被酶標(biāo)反應(yīng)板：用pHl0.6，50mmol/L碳酸鈉溶液將抗CMcAb稀釋成10ug/mL，每孔加100uL，4℃ 16h。次日取出每孔加含1％（W/V）明膠的PBSl50gL，室溫lmin；然后用PBS-Tween 20洗滌一次。
3. 樣本中CSa的檢測：
洗滌后的酶標(biāo)板，每孔加入方法1）、2）或3）處理的血漿樣本zoot&，4℃16h，用PBS-Tween20洗滌1次，每孔加入用含0．1％明膠的PBS-T稀釋的兔抗人CSa-IgC．多克隆抗體（46ug/mL）100t&，室溫2h，用PBS-Tween20洗滌3次；每孔加入用含0.1％明膠PBS-T稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的豬抗兔IgClOOt&（稀釋前l(fā)mL過氧化物酶偶聯(lián)物內(nèi)加100ul無關(guān)鼠McAb、10ul人血漿或10ul激活的人血清處理），室溫2min，每孔用PBS-Tween20洗滌4次；每孔加入底物溶液100ul，lmin后以PBS-T調(diào)零，每3min于酶標(biāo)儀405nm處讀取OD值。以O(shè)D/min增加量計算過氧化物酶活性。其活性與血漿中C含量呈正相關(guān)。本法zui低檢測極限為1ng/mL，此法未檢測出正常人新鮮血漿中的C。
4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取已知濃度純化的C，對倍稀釋成一系列不同的濃度（0.039-5.000ng/mL），分別加入包被有抗CMcAb的酶標(biāo)板中，然后按上述方法依次加入兔抗人C-IgC和過氧化物酶偶聯(lián)的豬抗兔IgC及過氧化物酶的底物，以PBS-Tween調(diào)零點，讀取OD40s/min增加量，以C（desarg）濃度為橫坐標(biāo)，OD40s/minx 200為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)取6個已知濃度的純化C。