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甲醛變性電泳
點(diǎn)擊次數(shù)：294 發(fā)布時(shí)間：2013-1-28
實(shí)驗(yàn)原理
提取樣品的總RNA后，一般根據(jù)RNA的凝膠電泳圖來判斷RNA的質(zhì)量。由于RNA容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此常用甲醛變性膠來進(jìn)行RNA電泳，得到的電泳圖能真實(shí)反映RNA的質(zhì)量狀況。將RNA通過凝膠電泳使之在凝膠中分離出來，通過加入標(biāo)準(zhǔn)核酸分子（markers）對(duì)其進(jìn)行鑒定，并用于轉(zhuǎn)膜、雜交等。
實(shí)驗(yàn)試劑
1. DEPC 水的處理：用量筒量取去離子水2L，在通風(fēng)櫥中，加入2ml DEPC到2L去離子水中，終濃度為0.1%的DEPC。迅速蓋上蓋子，混勻，然后放在搖床中中速搖蕩至少4hr，再高壓滅菌。滅菌時(shí)將瓶蓋松開，15磅滅菌20min。
2. 10×MOPS緩沖液（即10×FA緩沖液）： 500ml
0.2mol/L MOPS（3-〔N-嗎啉〕丙磺酸）
80mmol/L NaAc
10mmol/L EDTANa2
先用400 ml DEPC水溶解20.6g MOPS和4.1gNaAc后，加入10ml 0.5mol/L EDTA，定容500ml。用0.22mm濾器過濾除菌，裝入棕色瓶中，室溫避光保存。
或0.2mol/L MOPS（3-〔N-嗎啉〕丙磺酸）
50mmol/L NaAc
10mmol/L EDTA
用2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0，臨用時(shí)用DEPC水稀釋。
3. 1×MOPS電泳緩沖液（即1×甲醛變性膠電泳緩沖液1×running buffer）：1500ml
10×MOPS 150ml
37%甲醛 80ml
加水至1500ml，一般在3次電泳結(jié)束后需更換此電泳緩沖液。
4. 5 × 甲醛變性膠加樣緩沖液（5×loading buffer）： 10ml
預(yù)先配制水飽和的溴酚藍(lán)溶液：在1.5ml 離心管中加入約0.1mg溴酚藍(lán)，加入1ml DEPC水溶解，充分振蕩溶解，離心，可見離心管底部有溴酚藍(lán)粉末剩余，上層液體即水飽和的溴酚藍(lán)液。在15ml滅菌離心管中，依次加入以下各種成分：
4.0ml 10 × FA buffer
3.1ml 甲酰胺
2.0ml 100%的甘油
720ul 37%的甲醛
80ul 0.5MEDTA （PH 8.0）
16ul 水飽和的溴酚藍(lán)
100ul DEPC水
混勻，分裝，-20℃保存，常用放4℃保存。
或 甲醛凝膠變性RNA電泳加樣緩沖液（10×）： 10
50％甘油
1mmol/L EDTA
0.25％溴酚藍(lán)
0.25％二甲苯氰
5ml甘油、20ul 0.5mol/L EDTA、25mg溴酚藍(lán)、25mg二甲苯氰，加DEPC水至10ml，高壓后，4°C保存。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 電泳設(shè)備
2. 紫外燈
實(shí)驗(yàn)步驟
1．電泳槽用0.3%H2O2浸泡30min，DEPC水沖洗晾干。
2．鋪膠（40ml）
瓊脂糖 0.55g
DEPC水 36ml
10×MOPS 5ml
37%甲醛 9ml
稱0.55克瓊脂糖加36ml DEPC水，微波爐加熱溶解瓊脂糖，肉眼觀察無顆粒狀懸浮物。冷卻至50-60℃，加9ml 甲醛（37%）和5ml 10×電泳緩沖液，然后灌制凝膠，插入合適長(zhǎng)度和寬度的梳子，于室溫放置30分鐘以上使凝膠凝固。
3．RNA樣品處理（以一條泳道為例）一般取0.3 g的總RNA，加入1/5體積的5×加樣緩沖液，65℃加熱5 min，冰上驟冷，以消除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。建議上樣前在RNA樣品中加入0.5-1.0 ul的溴化乙錠（EB，濃度1.0 mg/mL），而不在膠中加EB，這樣電泳后的背景較低。配好的甲醛變性膠先在1×甲醛變性膠電泳緩沖液中預(yù)電泳15min。RNA樣品在5-10 V/cm的電壓降下電泳30min。
4．加2.0ml甲醛凝膠加樣緩沖液（10×）
5．加樣和電泳
將凝膠預(yù)電泳15min，電壓降為5-10 v/cm。隨后加樣品和標(biāo)準(zhǔn)物，以3-4v/cm電壓降電泳，電泳液為1×MOPS電泳緩沖液。直至溴酚藍(lán)遷移至膠下游的3/4處。
6．電泳結(jié)束后，在紫外燈下，仔細(xì)測(cè)量28S rRNA和18S rRNA至加樣孔的距離，并同熒光尺一起拍照，以記錄標(biāo)準(zhǔn)物的位置。
注意事項(xiàng)
1．每一泳道至多可分析30mg RNA，通常用10-20mg總RNA進(jìn)行Northern雜交，可以檢測(cè)高豐度mRNA（占mRNA總量的0.1%以上）；如待測(cè)RNA含量極微，每個(gè)泳道加0.5-3.0mg poly（A） RNA。
2． 標(biāo)準(zhǔn)物28S rRNA≥6333 base；18S rRNA≥2366 base；9S兔b珠蛋白mRNA≥710 base。溴酚藍(lán)在前（≥300bp），二甲苯氰FF在后（≥4kb）。