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慢病毒的濃縮與純化
點擊次數(shù)：949 發(fā)布時間：2012-6-19
方法一 超速離心沉淀法
1. 取6個Ultra-clear SW28離心管,用70%乙醇消毒后,放在超凈工作臺中打開紫外燈繼續(xù)消毒30分鐘.
2. 每個Ultra-clear SW28離心管中加入約32ml的預(yù)先處理的病毒上清液.
3. 取一支10ml的移液管,吸取12 ml 20%的蔗糖溶液.將移液管一直插入到離心管的底部,緩慢將蔗糖溶液打出4 ml.同樣地,將剩下8 ml的蔗糖溶液分別加入到另兩個離心管中.另取一支干凈的移液管,對剩下3管進(jìn)行同樣處理.
4. 用PBS調(diào)整各管的重量,使對應(yīng)的離心管之間的重量相差不超過0.1g.
5. 按次序?qū)⑺?個離心管放入Beckman SW28 超速離心轉(zhuǎn)頭中.
6. 4℃,25,000 rpm. （82,700g） 離心2小時.
7. 小心將管子從轉(zhuǎn)頭中取出.倒掉上清,將離心管倒扣在紙巾上放置10分鐘使剩余的上清流干.吸掉剩余的液滴.在管底應(yīng)當(dāng)有可見的沉淀.
8. 每管中加入100ml 不含鈣和鎂的PBS洗下沉淀.
9. 將SW28超速離心管插入到50ml錐底離心管中,蓋上蓋子.
10. 在4℃溶解2小時,每隔20分鐘輕輕震蕩.
11. 4℃,500g離心1分鐘,使溶液集中于管底.
12. 用200μl 移液器輕柔吹打使沉淀重懸.避免產(chǎn)生泡沫.將所有管中的液體集中到一個SW28離心管中.
13. 集中后的病毒懸液分裝成50μl 每份,保存在成品管中.用碎干冰速凍后儲存在-80 ℃.
方法二 PEG-8000濃縮法
1. 5X PEG8000+NaCl配制 稱取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q純水中；121攝氏度 30min 濕熱滅絕 30min；保存在4℃.
2. 使用0.45μm濾頭過濾慢病毒上清液；
3. 每30ml過濾后的病毒初始液,加入5X PEG-8000+NaCl母液7.5 ml；
4. 每20～30min混合一次,共進(jìn)行3-5次；
5. 4度放置過夜；
6. 4度,4000 g,離心 20min；
7. 吸棄上清,靜置管子1～2分鐘,吸走殘余液體；
8. 加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
9. 集中后的病毒懸液分裝成50 μl每份,保存在成品管中.用碎干冰速凍后儲存在-80 ℃