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YIJI動物線粒體呼吸鏈復合物I活性定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI動物線粒體呼吸鏈復合物I（NADH－輔酶Q還原酶）活性定量檢測試劑是一種旨在使用合成輔酶Q同功類似物和抑制復合物，通過反應系統(tǒng)測定樣品中特異性氧化還原酶（oxidoreductase）的活性，即采用比色法測定其氧化后雙峰差值（NADH濃度）的變化，以此進行測算單位酶活性的而經(jīng)典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種組織或細胞的純化線粒體樣品（動物或人體）還原型*腺嘌呤二核苷酸（NADH）－輔酶Q還原酶的特異性活性檢測。被用于衰老、能量代謝、蛋白組學、病理生理學、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應優(yōu)化，檢測敏感。

技術背景

線粒體呼吸鏈復合物I，通常稱為還原型*腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase）,是線粒體電子傳遞鏈中zui大的結構成分，含有30至40多個多肽結構，其zui特征性的酶活性是魚藤酮敏感的還原型*腺嘌呤二核苷酸－輔酶Q還原酶（NADH:Q Reductase）。復合物I催化線粒體內(nèi)電子由供體NADH傳遞到內(nèi)膜上輔酶Q受體（泛醌；ubiquinone）的能量轉移反應，為整個呼吸鏈反應系統(tǒng)的*步。NADH－輔酶Q還原酶反應系統(tǒng)測定NADH的濃度變化（340nm和380nm的時間差值），其反應方式為：

氧化還原酶

NADH +H＋ + CoQ       ≒      NAD－ + CoQH2

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI緩沖液（Reagent A）                          毫升

YIJI反應液（Reagent B）                        毫升

YIJI陰性液（Reagent C）                        毫升

YIJI專性液（Reagent D）                        微升

產(chǎn)品說明書           1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，YIJI緩沖液（Reagent A）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸；YIJI反應用戶自備

比色杯：用于比色的容器

雙波長分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI反應液（Reagent B）注意避光。然后進行下列操作。

一、測定準備

1．   準備好待測樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里（建議檢測前溶解線粒體）

2．   設定好雙波長分光光度儀（溫度為30℃）：波長分別為  nm和  nm，時延  秒，間隔  分鐘，讀數(shù)  次（共  分鐘），并置零

二、背景對照測定

3．   移取  微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色杯

4．   加入  微升YIJI反應液（Reagent B）

5．   加入  微升YIJI陰性液（Reagent C）

6．   上下傾倒數(shù)次，混勻

7．   即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照：

（  波長讀數(shù)－  波長讀數(shù)）  分鐘－（  波長讀數(shù)－  波長讀數(shù)）  分鐘

三、樣品活性測定

8．   移取  微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色杯

9．   加入  微升待測樣品

10．加入  微升YIJI反應液（Reagent B）

11．上下傾倒數(shù)次，混勻

12．即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)：

（  波長讀數(shù)－  波長讀數(shù)）  分鐘－（  波長讀數(shù)－  波長讀數(shù)）  分鐘

13．（選擇步驟）重復實驗步驟8至12，測讀新的樣品

四、樣品失活測定

14．移取  微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色杯

15．加入  微升待測樣品

16．加入  微升YIJI專性液（Reagent D）

17．加入  微升YIJI反應液（Reagent B）

18．上下傾倒數(shù)次，混勻

19．即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品失活讀數(shù)：

（ 波長讀數(shù)－  波長讀數(shù)）  分鐘－（  波長讀數(shù)－  波長讀數(shù)）  分鐘

五、計算樣品活性

1）樣品總活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[  （樣品容量，毫升）X   （毫摩爾吸光系數(shù)）]＝毫摩爾/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝毫摩爾/毫克或者[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[  （樣品重量，毫克）X  （毫摩爾吸光系數(shù)）]＝毫摩爾/毫克

2）樣品特異活性

樣品活性測定－樣品失活測定＝樣品特異活性

注意事項

1．   本產(chǎn)品為22次操作，包括1次背景對照測定和1次樣品失活測定

2．   所有操作均須無菌狀態(tài)下進行

3．   操作時，須戴手套

4．   YIJI緩沖液（Reagent A）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸

5．   系統(tǒng)操作過程中，背景測定和失活測定只需1次

6．   線粒體樣品檢測前，須溶解；建議凍存融解循環(huán)3次或使用YIJI線粒體溶解試劑盒－YJ10018

7．   加樣后即刻比色測定

8．   反應1分鐘后比色測定值趨于穩(wěn)定；測定值由高到低變化；測定持續(xù)5分鐘

9．   測定讀數(shù)為5分鐘和0分鐘的差值的值

10．比色測定后，比色杯須清洗*

11．建議待測樣本的OD340為0.2至0.8為理想狀態(tài)

12．如果用戶沒有雙波長同步測定分光光度儀，可以使用單波長340nm替代，注意活性計算時，毫摩爾吸光系數(shù)改為6.2

13．樣品特異活性是指魚藤酮敏感的還原型*腺嘌呤二核苷酸－輔酶Q還原酶，排除其它干擾因素（例如復合物II/III/IV等）

14．本公司提供系列線粒體及其酶類技術產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1．   本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能*穩(wěn)定

2．   本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確可靠